"Entwicklung und Validierung des CERVICARE-LMT Tests" im Rahmen des Eurostars Projekts E! 1800 Precare "Predicting cervical abnormalities and regression"

Abstract

Das Projekt "PREdicting Cervical Abnormalities and REgression" (Akronym Precare) entwickelte in Zusammenarbeit mit den internationalen Partnern und den Industriepartnern in vitro Diagnostiktests für den Einsatz im Zervixkarzinomscreening. Es wurden 2 Testsysteme entwickelt und gegeneinander validiert, die auf zwei verschiedenen methodischen Testplattformen vergleichbare Ergebnisse bringen sollten. Hierzu wurde die quantitative Bestimmung von mRNA als Biomarker von Zellen, die durch Humane Papillomviren (HPV) infiziert wurden und potentiell auf dem Entwicklungsweg zu einem Zervixkarzinom sind, herangezogen. Die mRNA Detektion und Quantifizierung erfolgte zum einen mittels ciRNASeq, also einer Sequenzierungstechnik, die im Hochdurchsatzverfahren (ca. 900 Proben parallel) angewendet werden kann und hochgradig multiplexierbar ist, d. H. eine hohe Anzahl an mRNA Biomarkern können gleichzeitig bestimmt werden. Zum anderen wurde eine Plattform verwendet, QuantiGene 2.0, die einen niedrig- bis mittelhohen Durchsatz von Proben parallel erlaubt (ca. 90) und nur eine Anzahl von ca. 80 Biomarkern parallel detektieren kann. Beide in vitro Diagnostikmethoden werden aber als ergänzend betrachtet je nach Probenaufkommens und Anwendungsweise. Die Sequenzierung soll bei zentralisierter biomedizinischer Analyse in spezialisierten Laboren zum Einsatz kommen (high-income countries), während die technisch weniger komplexe Methode QuantiGene im Screening in Ländern mit niedrigem/mittlerem Einkommen Anwendung finden könnte. Aber auch wenn das Probenaufkommen gering oder dezentralisiert gemessen werden soll. Der Einsatz beider Tests ist zunächst als Ergänzung (Triage) der HPV-basierten Screeningtestung gedacht, kann diese aber später auch ersetzen. Beide in vitro Diagnostiksysteme verbessern die Spezifität des Screeningergebnisses, also den Ausschluss falsch-positiver Befunde durch die gleichzeitige Bestimmung von HPV Präsenz, anhand der Onkogenexpression der HPV und der Evaluation von zellulären Biomarkern, die im Laufe der Progression zum invasiven Karzinom differentiell hochreguliert werden. Die Auswahl der informativen Biomarker erlaubt eine molekulare Bestimmung des gerade vorliegenden Schweregrades (Progressionsfortschritts) der durch HPV hervorgerufenen Gewebeveränderung. Dadurch können frühe Infektionen, verschiedene Vorstufen (sog. CIN 1, 2 oder 3) und das bereits invasive Karzinom mit hoher Akkuratheit identifiziert und unterschieden werden. Diese erreicht die Genauigkeit von histomorphologischer Beurteilung durch Pathologen, benötigt aber weit wenigen Aufwand ein Ergebnis zu erzielen. Beim QuantiGene-basierten Verfahren reicht der initiale Screeningabstrich vom Gebärmuttermund aus während die Histopathologie weitere Arztbesuche, Gewebeprobenahme und -aufarbeitung sowie subjektive Interpretation benötigt. Dies schlägt sich in der Belastung der Frauen und den Kosten für das Gesundheitssystem nieder. Im Laufe des Projektes war die Aufgabe die als prinzipiell durchführbar gezeigte Methode weiter zu entwickeln, z. B. Positivkontrollen, Abarbeitungsprotokolle, die Verwendung unterschiedlicher Eingangsmaterialien, Vergleiche zwischen den Plattformen und insbesondere die Vergleichbarkeit der Testergebnisse zu untersuchen. Nach der technischen Validierung und Kreuztestung von gleichem Probenmaterial sollte in einer Studie an klinischem Material (retrospektiv und prospektiv) die Leistungsdaten der Tests (Sensitivität zur Detektion von CIN2 und höher; Spezifität für den Ausschluss falsch-positiver Ergebnisse, d. H. <CIN2 Dysplasien und Infektionen, die beobachtet aber nicht therapiert werden; die Akkuratheit der Messergebnisse; sowie der direkte Vergleich zu Standardscreeningtests (HPV Nachweis und zytologische Testung)) erfolgen. Diese Studien wurden an Probenmaterial aus den laufenden Screeningprogrammen in Deutschland und den Niederlanden durchgeführt, aber auch für den QuantiGene-basierten Test in Studien und an Material aus Sub-Sahara Afrika. Insgesamt wurden alle Ziele des Antrags erreicht, unter Ausnahme eines Teilprojekts, bei dem die Integration des viralen Genoms in das Genom der Zelle nachgewiesen werden sollte. Da diese Integration aber nicht zwangsläufig erfolgt, war der Wert als Biomarker für Progression fraglich und stattdessen wurden weitere Expressions-Biomarker für die Progression und Regression einer Krebsvorstufe identifiziert. Die in vitro Diagnostiktests wurden auf Konferenzen vorgestellt und aus den Diskussionen wurde ersichtlich, dass sie ein wichtiges Problem des Screenings lösen werden. Die Frauen mit wirklich therapie-obligaten Gewebeveränderungen werden schneller identifiziert und jene viel häufigeren (ca. 90%) mit geringer und meist spontan ausheilender Gewebeveränderung wird eine weitergehende Abklärung damit Beunruhigung und Übertherapie erspart. Beide Testsysteme sind in Kommerzialisierung und das Gesamtprojekt kann als erfolgreich abgeschlossen eingestuft werden. The "PREdicting Cervical Abnormalities and REgression" project (acronym: Precare) developed in vitro diagnostic tests for use in cervical cancer screening in collaboration with international and industry partners. Two test systems were developed and validated against each other; these were designed to deliver comparable results on two different methodological test platforms. To this end, the quantitative determination of mRNA was used as a biomarker for cells infected with human papillomaviruses (HPV) that may be on the path to cervical cancer. mRNA detection and quantification were performed, on the one hand, using ciRNASeq - a sequencing technique that can be applied in a high-throughput process (approximately 900 samples in parallel) and is highly multiplexable, meaning a large number of mRNA biomarkers can be determined simultaneously. On the other hand, a platform called QuantiGene 2.0 was used, which allows for low- to medium-throughput parallel analysis of samples (approximately 90) and can detect only about 80 biomarkers simultaneously. However, depending on sample volume and application, both in vitro diagnostic methods are considered complementary. Sequencing is intended for use in centralized biomedical analysis in specialized laboratories (high-income countries), while the technically less complex QuantiGene method could be used for screening in low- and middle-income countries. This also applies when the sample volume is low or when testing is to be conducted decentralized. The use of both tests is initially intended as a supplement (triage) to HPV-based screening, but may later replace it. Both in vitro diagnostic systems improve the specificity of the screening result - that is, they help rule out false-positive findings by simultaneously determining the presence of HPV based on HPV oncogene expression and by evaluating cellular biomarkers that are differentially upregulated during the progression to invasive carcinoma. The selection of informative biomarkers allows for a molecular determination of the current severity (stage of progression) of the tissue changes caused by HPV. This makes it possible to identify and distinguish between early infections, various precancerous stages (known as CIN 1, 2, or 3), and invasive carcinoma with a high degree of accuracy. This method achieves the same accuracy as histomorphological assessment by pathologists but requires far less effort to produce a result. With the QuantiGene-based method, an initial screening swab from the cervix is sufficient, whereas histopathology requires additional doctor visits, tissue sampling and processing, as well as subjective interpretation. This translates into a burden on women and costs for the healthcare system. Over the course of the project, the task was to further develop the method - which had been shown to be feasible in principle - by, for example, investigating positive controls, processing protocols, the use of different input materials, comparisons between platforms, and, in particular, the comparability of test results. Following technical validation and cross-testing of identical sample material, a study using clinical material (retrospective and prospective) was to assess the performance data of the tests (sensitivity for detecting CIN2 and higher; specificity for ruling out false-positive results, i.e., <CIN2 dysplasia and infections that are observed but not treated; the accuracy of the measurement results; as well as a direct comparison with standard screening tests (HPV detection and cytological testing)). These studies were conducted using specimen material from ongoing screening programs in Germany and the Netherlands, as well as in studies and on material from sub-Saharan Africa for the QuantiGene-based test. Overall, all objectives of the grant proposal were achieved, with the exception of one subproject that aimed to detect the integration of the viral genome into the cell’s genome. However, since this integration does not necessarily occur, its value as a biomarker for progression was questionable; instead, additional expression biomarkers for the progression and regression of precancerous lesions were identified. The in vitro diagnostic tests were presented at conferences, and the discussions made it clear that they will solve a major problem in screening. Women with tissue changes that truly require treatment are identified more quickly, while the much more common cases (approximately 90%) involving minor tissue changes - which usually resolve spontaneously - are spared further testing, thereby avoiding unnecessary anxiety and overtreatment. Both test systems are in the process of commercialization, and the overall project can be considered successfully completed.