Entwicklung eines synthetischen Stoffwechselwegs für die Kohlenstoff-konservierende Synthese von chemischen Wertstoffen aus Ethylenglykol

Abstract

Die Nutzung des Klimagases CO2 als Rohstoffquelle für chemische Produktsynthesen ist Gegenstand intensiver Forschung. Eine Möglichkeit, CO2 einer chemischen Wertschöpfung zuzuführen, besteht in dessen (elektro)chemischer Reduktion zu den Alkoholen Methanol oder Ethylenglykol. Beide Verbindungen können mikrobiell zu zahlreichen Chemikalien umgewandelt werden. Dabei ist es wichtig zu betonen, dass alle Stoffwechselwege zur Nutzung von Ethylenglykol prinzipiell kompatibel sind mit der Nutzung von Methanol, da das Zwischenprodukt Glykolaldehyd auch aus Methanol über die Zwischenstufe Formaldehyd hergestellt werden kann. Ziel dieses Projekts war der Aufbau eines synthetischen Stoffwechselwegs, der Ethylenglykol zu 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) umwandeln kann. DHB ist ein Vorläufermolekül für das Methionin-Analogon 2-Hydroxy-4-methylthiobutyrat, welches vor allem als Futtermittelzusatzstoff in der Hühnermast zum Einsatz kommt. Darüber hinaus wird es als Monomer für die Entwicklung neuartiger Biokunststoffe getestet. Der Stoffwechselweg besteht aus sechs enzymatischen Reaktionen und verläuft über die charakteristischen Zwischenprodukte Glykolaldehyd und Threose verläuft. Daher wurde er als synthetischer Stoffwechselweg zur Threose-abhängigen Assimilation von Glykolaldehyd (STEGA pathway) in die Literatur eingeführt. In der ersten Projektphase wurden Enzyme für alle benötigten Aktivitäten identifiziert. Diese wurden anschließend im Produktionsstamm Escherichia coli exprimiert, um in einem ersten proof-of-concept zu zeigen, dass der Stoffwechselweg funktioniert. Anschließend wurde gezeigt, dass der synthetische Stoffwechselweg auch an die Biosynthese von Threonin gekoppelt werden kann. Abschließend lag der Fokus auf der Verbesserung ausgewählter Enzyme des Stoffwechselwegs. Durch gezieltes Proteinengineering wurde eine unerwünschte Nebenaktivität der Threose-Aldolase ausgeschaltet, um so Kohlenstoffverluste zu reduzieren. Des Weiteren wurde die Aktivität der Threose-Dehydrogenase stark gesteigert, und so der Kohlenstofffluss durch den Stoffwechselweg erhöht. Die Expression der verbesserten Enzyme in einem E. coli Stamm führte zu einer Verbesserung des DHB Ertrags und ermöglichte die Herstellung von 5,2 mM DHB bei einem Er-trag von 0,16 Cmol/Cmol in einfachen Schüttelkolbenkulturen. Begleitend zu diesen Arbeiten wurden in einer Übersichtsarbeit die Kohlenstoffeffizienzen von natürlichen und synthetischen Stoffwechselwege für die Assimilation von Methanol und Ethylenglykol für die Produktion repräsentativer Chemikalien verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die synthetischen Stoffwechselwege deutlich höhere Kohlenstofferträge bei der Herstellung von Chemikalien aufweisen als natürliche, was die Notwendigkeit der Entwicklung synthetischer Reaktionssequenzen belegt. The use of the greenhouse gas CO2 as a carbon feedstock for the synthesis of chemicals has become a major focus of research. One promising strategy for incorporating CO2 into chemical value chains is its (electro)chemical reduction to the alcohols methanol or ethylene glycol. Both compounds can subsequently be converted by microorganisms into a wide range of chemicals. Importantly, all metabolic pathways for ethylene glycol utilization are, in principle, compatible with methanol utilization, since the key intermediate glycolaldehyde can also be produced from methanol via formaldehyde. The objective of this project was to establish a synthetic metabolic pathway capable of converting ethylene glycol into 2,4-dihydroxybutyrate (DHB). DHB is a precursor of the methionine analogon 2-hydroxy-4-methylthiobutyrate, which is widely used as a feed additive in poultry diets. In addition, it is being investigated as a monomer for the development of novel bioplastics. The pathway comprises six enzymatic reactions and proceeds via the characteristic intermediates glycolaldehyde and threose. It has therefore been introduced in the literature as the synthetic metabolic pathway for threose-dependent assimilation of glycolaldehyde (STEGA pathway). During the first phase of the project, enzymes catalyzing all required reaction steps were identified. These enzymes were subsequently expressed in the production host Escherichia coli to provide an initial proof of concept demonstrating the functionality of the pathway. It was then shown that the synthetic pathway can also be coupled to threonine biosynthesis. The final phase of the project focused on improving selected pathway enzymes. Through targeted protein engineering, an undesirable side activity of the threose aldolase was eliminated, thereby reducing carbon losses. Furthermore, the activity of the threose dehydrogenase was strongly increased, leading to enhanced carbon flux through the pathway. Expression of the engineered enzymes in an E. coli production strain improved DHB yields and enabled the production of 5.2 mM DHB with a yield of 0.16 C-mol/C-mol in simple shake-flask cultures. In parallel with these experimental studies, a review was conducted which compared the carbon efficiencies of natural and synthetic metabolic pathways for the assimilation of methanol and ethylene glycol in the production of representative chemicals. The analysis demonstrated that synthetic pathways achieve substantially higher carbon yields than their natural counterparts, highlighting the importance of developing synthetic reaction sequences for efficient carbon utilization.