JPIAMR Transnationale Initiative "Phage therapy to reduce AMR enterobacteria spread from a One Health perspective" (Phage-STOP-AMR); Teilvorhaben "Charakterisierung von Bakteriophagen zur spezifischen Reduktion antibiotikaresistenter Enterobakterien"

Abstract

Derzeitiger Stand von Wissenschaft und Technik: Multiresistente (MDR) enterobakterielle Erreger wie Salmonellen und E. coli stellen ein wachsendes globales Problem für die öffentliche Gesundheit dar, da sie Zoonosen verursachen und als Reservoir für Antibiotikaresistenzgene dienen können. Das Projekt zielte auf die Charakterisierung und Anwendung Plasmid-abhängiger Phagen zur gezielten Bekämpfung resistenter Bakterien bei Masthähnchen. Phagentherapie bietet eine vielversprechende Alternative zur Bekämpfung dieser Resistenz, insbesondere durch gezielte Reduktion resistenter Bakterien im Tierdarm und Verhinderung der Übertragung auf den Menschen. Ein ungedeckter Bedarf besteht darin, die Übertragung von Resistenzplasmiden auf andere gefährliche Erreger zu unterbinden und das Reservoir zoonotischer Resistenzgene zu verringern. Ein tiefes Verständnis der Phagen-Plasmid-Wirt-Dynamik ist entscheidend für eine optimierte Phagentherapie zur Reduktion resistenter Bakterien in Nutztieren und zur Minimierung des Risikos einer Ausbreitung auf den Menschen und die Umwelt. Phagen, die auf Strukturen des Konjugationsapparates abzielen, können die Anzahl resistenztragender Bakterien reduzieren, wobei die Entwicklung phagenresistenter Mutanten eine Herausforderung darstellt, die durch Phagencocktails adressiert werden kann. Die Auswirkungen der Phagentherapie auf die Darmmikrobiomzusammensetzung bedarf weiterer Forschung.

Begründung/Zielsetzung der Untersuchung: Das Projekt adressiert angesichts der wachsenden Bedrohung durch multiresistente bakterielle Zoonoseerreger, wie Salmonellen und E. coli, einen wichtigen Aspekt für die öffentliche Gesundheit. Diese Erreger können über Lebensmittel und Umweltreservoirs auf den Menschen übertragen werden und stellen eine ernsthafte Herausforderung für die Behandlung bakterieller Krankheiten dar. Insbesondere die Übertragung von Resistenzplasmiden auf andere humanpathogene Bakterien und die Rolle von Nutztieren als Reservoir für resistente Erreger erfordern dringende Maßnahmen. Da der Einsatz von Antibiotika die Resistenzentwicklung fördert, ist die Phagentherapie eine vielversprechende und nachhaltige Alternative zur gezielten Bekämpfung dieser Bakterien und zur Verhinderung ihrer Übertragung. Ein tiefes Verständnis der Phagen-Plasmid-Wirt-Dynamik ist essenziell, um die Phagentherapie zu optimieren und das Risiko einer Ausbreitung resistenter Bakterien zu minimieren. Das Projekt adressierte somit einen wichtigen ungedeckten medizinischen Bedarf. Die gewonnenen Ergebnisse leisten einen wichtigen Beitrag zur Optimierung der Bekämpfung der Antibiotikaresistenz und zur Sicherstellung der Lebensmittelsicherheit.

Methode: Die Arbeiten beinhalteten die Etablierung von Phagensammlungen und die Testung isolierter Plasmid-abhängiger Phagen auf spezifische Lyse Plasmid-tragender resistenter Bakterien. Ausgewählte Phagen wurden auf ihre Wirkung in vitro und ex vivo (Hühnerdarmmodell) sowie in vivo unter Aufzuchtbedingungen bei der Geflügelmast untersucht. Dabei stand die Frage im Mittelpunkt, wie sich die Phagenbehandlung auf die Resistenzgenübertragung und die Zusammensetzung des Darmmikrobioms und Resistoms in Masthähnchen auswirkt. Zudem wurden DNA-basierte Methoden zur Erkennung von Resistenzgenen und Erregern entwickelt zur Überwachung der Resistenzentwicklung in Geflügelbetrieben und der Umwelt.

Ergebnis: Das Projekt untersuchte umfassend die Rolle von Bakteriophagen bei der Reduzierung multiresistenter E. coli und Salmonella im Masthähnchen-Darm. Work Package 1 konzentrierte sich auf die Identifizierung und Charakterisierung plasmidspezifischer Phagen, wobei fünf Kandidaten identifiziert wurden, die selektiv Plasmid-kodierte Strukturen als Rezeptoren erkennen. Die Effizienz der Phagen wurde durch verschiedene Faktoren beeinflusst, darunter Bakterienhintergrund und Umweltbedingungen. Die Phagen wurden durch Fluoreszenzmarker versehen und anhand von FACS-Screening auf ihre Wirksamkeit getestet, wobei gezeigt wurde, dass sie die Plasmidzahl reduzieren und gleichzeitig Mutanten generieren, die die Konjugation verlieren. Für zwei Phagenkandidaten wurde im Work Package 2 bestätigt, dass sie die Anzahl der plasmidtragender Bakterien im ex vivo-Hühnerdarmmodell ohne signifikante Veränderungen der Mikrobiomzusammensetzung reduzierten. Im Feldversuch (Work Package 3) führte die orale Gabe eines Phagencocktails zu einer Verringerung der Häufigkeit von Masthühnern, die RP4-tragende Bakterien aufwiesen, unabhängig von der Bakterienart. Work Package 4 zeigte, dass das Resistenzplasmid RP4 im Mikrobiom der Masthähnchen verbreitet wurde und die Phagenbehandlung sowohl die Anzahl der Plasmiddonoren als auch den Plasmidtransfer reduzierte. Work Package 5 etablierte ein On-Site-Detektionsverfahren für Resistenzgene und Plasmide mittels qPCR und LAMP und zeigte den Nachweis von RP4 in verschiedenen Umweltproben nach der Stallreinigung, was auf eine Überlebensfähigkeit und mögliche Weiterverbreitung resistenter Elemente hindeutet. Insgesamt liefern die Ergebnisse des Projekts wertvolle Erkenntnisse über die Wirksamkeit von Plasmid-abhängigen Phagen bei der Bekämpfung multiresistenter Bakterien im Masthähnchen-Darm und bieten Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Strategien zur Eindämmung der Antibiotikaresistenz.

Schlussfolgerung/Anwendungsmöglichkeiten: Gegenmaßnahmen zur weiteren Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen erfordern einen "One Health"-Ansatz, der die Abhängigkeit zwischen menschlicher und tierischer Gesundheit sowie der Umwelt berücksichtigt. Strategien zur Reduzierung der Verbreitung von Resistenzdeterminanten sollten daher sektorübergreifend angelegt sein und die Human- und Veterinärmedizin, Landwirtschaft und Umwelt umfassen. Insbesondere die selektive Entfernung von Plasmid-tragenden resistenten Erregern aus dem Darm von Nutztieren, kombiniert mit Ansätzen zur Verringerung der Konjugationsrate, könnte dazu beitragen, Resistenzplasmide aus dem intestinalen Mikrobiom der Tiere zu entfernen und so die Ausbreitung in die Umwelt zu verhindern. Da Gülle und Mist als Düngemittel verwendet werden und hohe Konzentrationen resistenter Mikroorganismen enthalten können, ist dies auch relevant für die Lebensmittelsicherheit und die Vermeidung zoonotischer Infektionen. Der Einsatz von Phagencocktails, die auf Plasmid-kodierte Faktoren abzielen, die an der Konjugation beteiligt sind, bietet eine vielversprechende Möglichkeit, diese Ziele nachhaltig zu erreichen und die Prävalenz resistenter Bakterien sowie den Transfer von Resistenzplasmiden unter Bakterien zu reduzieren.

Current State of the art: Multiresistant (MDR) enterobacterial pathogens such as Salmonella and E. coli represent a growing global public health concern due to their zoonotic potential and ability to serve as reservoirs for antibiotic resistance genes. This project aimed to characterize and apply plasmid-dependent phages for targeted control of antibiotic-resistant bacteria in broiler chickens. Phage therapy offers a promising alternative to combating this resistance, particularly through targeted reduction of resistant bacteria in the animal gut and preventing transmission to humans. There is a need to prevent the transfer of resistance plasmids to other dangerous pathogens and reduce the reservoir of zoonotic resistance genes. A deep understanding of phage-plasmid-host dynamics is crucial for optimizing phage therapy to reduce resistant bacteria in livestock and minimize the risk of spread to humans and the environment. Phages targeting structures in the conjugation apparatus can reduce the number of bacteria carrying resistance plasmids. The development of phage-resistant mutants poses a challenge that can be addressed through phage cocktails. Further research is needed to understand the effects of phage therapy on pathogen eradication, animal health and the gut microbiome composition.

Aims of the study: Addressing the growing threat posed by multiresistant zoonotic bacterial pathogens like Salmonella and E. coli is critical for public health. These pathogens can be transmitted to humans through food and environmental reservoirs and pose a serious challenge to treating bacterial infections. Specifically, the transfer of resistance plasmids to other human pathogens and the role of livestock as reservoirs for resistant pathogens require urgent action. Because antibiotic use promotes resistance development, phage therapy represents a promising and sustainable alternative for targeted control of these bacteria and preventing their transmission. A better understanding of phage-plasmid-host dynamics is essential for optimizing phage therapy and minimizing the risk of spreading antibiotic resistance. This project addressed therefore an important unmet need, and the results obtained contribute significantly to optimizing the fight against antibiotic resistance and ensuring food safety.

Methods: The project involved establishing phage collections and testing isolated plasmid-dependent phages for specific lysis of plasmidcarrying resistant bacteria. Selected phages were tested for their effect in vitro and ex vivo (chicken gut model), as well as in vivo under broiler chicken rearing conditions. The central question was how phage treatment affects resistance gene transfer and the composition of the gut microbiome and resistome in broiler chickens. Additionally, DNA-based methods were developed to detect resistance genes and pathogens for monitoring resistance development in poultry farms and the environment.

Results: This project comprehensively investigated the role of bacteriophages in reducing multiresistant E. coli and Salmonella in the broiler chicken gut. Work Package 1 focused on identifying and characterizing plasmid-specific phages, identifying five candidates that selectively recognize plasmid-encoded structures as receptors. Phage efficiency was affected by various factors, including bacterial strain background and environmental conditions. Phages were labeled with fluorescent markers and tested for their efficacy using FACS screening, demonstrating a reduction in plasmid numbers and generation of bacterial mutants losing the ability to conjugate. Work Package 2 confirmed the reduction of plasmid-carrying bacteria in the ex vivo chicken gut model without significant changes in microbiome composition. In the field trial (Work Package 3), oral administration of a phage cocktail resulted in a decrease in the frequency of broiler chickens carrying RP4-carrying bacteria, regardless of bacterial species. Work Package 4 showed that the resistance plasmid RP4 spread in the broiler chicken microbiome and phage treatment reduced both the number of plasmid donors and plasmid transfer. Work Package 5 established an on-site detection method for resistance genes and plasmids using qPCR and LAMP and demonstrated detection of the resistance plasmid RP4 in various environmental samples under rearing conditions, but even after cleaning of the stable, indicating viability and potential further spread of resistant elements. Overall, the project results provide valuable insights into the efficacy of plasmid-dependent phages in combating multiresistant bacteria in broiler chickens and offer starting points for developing new strategies to curb antibiotic resistance.

Conclusion/application possibilities: Countermeasures to further spread antibiotic resistance require a "One Health" approach recognizing the interdependence between human and animal health and the environment. Strategies to reduce the spread of resistance determinants should therefore be cross-sectoral and encompass human and veterinary medicine, agriculture, and the environment. In particular, selective removal of plasmid-carrying resistant pathogens from the gut of livestock, combined with approaches to reduce conjugation rates, could contribute to removing resistance plasmids from the intestinal microbiome of animals and preventing their spread into the environment. Because manure and slurry are used as fertilizers and can contain high concentrations of resistant microorganisms, this is also relevant to food safety and preventing zoonotic infections. Using phage cocktails targeting plasmid-encoded factors involved in conjugation offers a promising way to achieve these goals sustainably and reduce the prevalence of resistant bacteria and the transfer of resistance plasmids between bacteria.