SNiPoCC Verbundprojekt 1 - Steigerung der Sensitivität und Erweiterung des Analytportfolios von POC-Tests (AnaPOC); Teilprojekt: Entwicklung von funktionalisierten Magnetpartikeln und Farbstoffkonjugaten zur Isolierung und Detektion von Spermien

Abstract

Die technischen Ziele des von der IBA bearbeiteten Teilvorhabens umfassten die Sensitivitätssteigerung von POC-Tests durch die Herstellung neuer Ligand-Farbstoffkonjugate, die Herstellung Spermien-spezifischer Antikörper und der Entwicklung magnetischer Agarosebeads zur Anreicherung und Isolation ebendieser Spermien aus forensischen Proben. Diese Entwicklungen sollten über die Strep-tag Technologie miteinander verbunden sein, sodass es möglich sein sollte, entwickelte Strep-getaggte Antikörper mittels Strep-Tactin oder Strep-Tactin XT Agarosen zu binden und mittels Strep-Tactin bzw. Strep-Tactin XT Farbstoffkonjugaten zu detektieren. Gleichzeitig sollten die entwickelten Produkte eine Erweiterung des IBA Lifesciences Produktportfolios zur Zell-/Proteinisolation und -detektion bilden. Wie bereits in Teil II – Eingehende Darstellung beschrieben konnten viele der angesetzten Arbeitspakete erfolgreich abgeschlossen werden. Von technischer Seite ist hierbei besonders die Verbesserung der, mit einer thermisch stabileren Strep-Tactin XT Variante, funktionalisierten magnetischen beads hervorzuheben. Im Rahmen des Teilprojekts konnte der Produktionsprozess evaluiert, umgestellt und verbessert werden. Dadurch ließ sich die Herstellung eines verbesserten Prototypen realisieren, der auch an den Projektpartner SERATEC geliefert werden konnte, um initiale Tests durchzuführen. Ebenso war es durch die Forschungsarbeiten möglich sowohl die Qualitätskontrolle der Eingangsreagenzien als auch der Endprodukte maßgeblich zu verbessern und diese in Form von Prüfprotokollen und Herstellungsprotokollen festzuhalten. Durch die Etablierung der Herstellung von magnetischen micro beads konnte in ersten Tests die Zellisolierungseffizienz noch weiter gesteigert werden, was allerdings durch weitere Tests bestätigt werden muss. Eine Aufnahme der Strep-Tactin XT micro bead Technologie in das Strep-tag Portfolio könnte sehr attraktiv werden, soll aber zunächst durch Marktanalysen untersucht werden. Des Weiteren ist davon auszugehen, dass die, während der Entwicklung gewonnenen, Erfahrungen bzgl. der Kopplung von Strep-Tactin®XT an magnetische Beads, in Zukunft die Entwicklung von magnetischen Agarosepartikeln beschleunigen werden. Ebenso werden sich die etablierten Protokolle und verbesserte Qualitätssicherungsmaßnahmen positiv auf zukünftige Produktentwicklungen auswirken. Die Verzögerungen in der Herstellung eines Spermien-spezifischen Antikörpers führten zur Verwendung zweier Antikörperfragmente (CD9 und CD81 Fab) aus dem Strep-tag Portfolio, welche sich als gute Kandidaten für die Isolierung von Spermienzellen herausstellten, da die entsprechenden Antigene auch bereits in der Literatur als Zielproteine für Antikörperreaktionen beschrieben wurden. Die erfolgreiche Verwendung dieser Fab-Fragmente in Kombination mit Strep-Tactin XT magnetic beads durch SERATEC ermöglicht in Zukunft Seitens der Proteinproduktion eine kostengünstigere Herstellung, da weniger komplexe Expressionssysteme zur Herstellung der Antikörperfragmente verwendet werden müssen als für die Expression von Antikörpern. Der explorative Ansatz der Proteinmodifikation mittels click Chemie bzw. Biotinylierung lieferte zudem sehr wichtige Erkenntnisse zum noch besseren Verständnis der Strep-tag Technologie. Im Falle der Biotinylierungsexperimente führte dies sogar dazu, dass das Anwendungsspektrum von, mit Strep-Tactin XT funktionalisierter, Agarose und magnetischen Beads auf biotinylierte Proteine erweitert werden konnte, was anschließend auch in Form einer Application Note veröffentlicht und auf einer Postersession einer Messe präsentiert wurde. Gleichzeitig zeigen diese Ergebnisse, dass es möglich wäre, biotinylierte Farbstoffmoleküle an Strep-Tactin XT Liganden zu binden. Ein auf diese Weise weiterentwickelter molekularer Baukasten könnte durch eine hohe Flexibilität (Bindung von Strep-getaggten oder biotinylierten Proteinen und Molekülen) für eine Vielzahl an Anwendungen im Bereich von PoC-Tests, aber auch der Forschung von Interesse sein. Neue Prozesse, auf Basis der durchgeführten Experimente, konnten auch für Strep-Tactin XT-basierte Farbstoffkonjugate etabliert werden. Neben der Entwicklung neuer Konjugate funktionalisiert mit Dyomics Farbstoffen, wurde ebenso der Technologietransfer von den Farbstoffkonjugaten Strep-Tactin PE und APC auf Strep-Tactin XT PE und APC Prototypen durchgeführt. Im Rahmen einer effizienteren Herstellung der neuen Farbstoffkonjugate wurden die Qualitätskontrollen überarbeitet und konnten verbessert werden. Der Projektpartner SERATEC war es mit den entwickelten Strep-Tactin XT-Dy-488 und -Dy-646 Farbstoffkonjugat-Prototypen möglich in ersten Tests Spermien Fluoreszenzmikroskopisch nachzuweisen. Die gesetzten Meilensteine des Projekts konnten alle erfolgreich bearbeitet und abgeschlossen werden. Hierbei wurden Aspekte wie beschrieben durch andere Entwicklungen ersetzt, die letztlich eine Verbesserung des Projektausgangs darstellen.