Modellregion, Phase 1, Bio4Mat-Pro: BoostLab1-8 - BioProNuk, Biokatalytische Produktionstechnik für Nukleotidzucker – Valorisierung von nachwachsenden Rohstoffen, TP1

Abstract

Wissenschaftlicher und technischer Stand Nukleotidzucker finden primäre Anwendung in der pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie. Im Pharmabereich dienen sie als Donorsubstrate für Leloir-Glykosyltransferasen zur Herstellung von humanen Milcholigosacchariden (HMOs), therapeutischen Glykoproteinen und Glykosaminoglykanen wie Heparin, Heparansulfat, Chondroitinsulfat und Hyaluronsäure. Ihre Verwendung wird jedoch durch begrenzte Verfügbarkeit und hohe Kosten (30-192 €/mg bei maximal 25 mg) eingeschränkt. Die AG Elling an der RWTH Aachen hat Enzymkaskaden entwickelt, um bis zu 14 Nukleotidzucker im Multi-Gramm-Maßstab zu synthetisieren. Ein abgeschlossenes AiF/ZIM-Projekt ("NukZuk") mit BIOLOG LSI und "SeSam Biot", das innovative Enzymkaskaden und ein Reaktorkonzept zur effizienten Synthese von Nukleotidzuckern mit integrierter Nukleotid-Regeneration entwickeln will. Der angestrebte biokatalytische Ansatz birgt wissenschaftliche und wirtschaftliche Risiken, insbesondere hinsichtlich der Langzeitstabilität der beteiligten Enzyme und möglicher Aktivitätsverluste durch Immobilisierung. Es werden alternative Lösungen benötigt, wie Reaktorstrategien mit löslichen oder gezielt immobilisierten Enzymen sowie Verbesserungen in der Aktivität und Spezifität der Kaskadenenzyme. Innovative Reaktorkonzepte für immobilisierte Multienzymsysteme sind bisher nicht beschrieben worden. Der geplante Einsatz von Membranreaktoren oder Festbettreaktoren ist innovativ, aber risikobehaftet, um eine großtechnische Synthese zu ermöglichen. Im Erfolgsfall könnte dies das finanzielle Risiko für Industriepartner verringern, da solche Entwicklungen ohne staatliche Förderung schwer realisierbar wären. Die Umsetzung erfordert spezielle Fachkenntnisse der Projektpartner. Aufgabenstellung Das Ziel des BioProNuk-Projekts ist die Entwicklung von Reaktoren für Enzymkaskaden zur Synthese von Nukleotidzuckern im Multi-Gramm- bis Multi-100g-Maßstab aus nachwachsenden Rohstoffen wie Saccharose, Pektin und Chitin. Im Fokus stehen Nukleotidzucker wie UDP-GalNAc, UDP-GlcNAc und GDP-Fuc. Aktuell hat das Verfahren jedoch noch nicht den erforderlichen technischen Reifegrad und die Wirtschaftlichkeit für eine industrielle Synthese erreicht und ist zudem sehr arbeitsintensiv. Um den nächsten Schritt in der wirtschaftlichen Produktion zu schaffen, verfolgt das Projekt drei grundlegende Aufgabenstellungen: Regeneration der teuren Nukleotid-Kofaktoren (Partner Biomat), Verbesserung der Kaskadenenzyme durch gerichtete Evolution (Partner Biotec), Entwicklung eines Enzymreaktors für eine Produktivität im Multi-Gramm bis 100g-Maßstab (Partner ITB). Die angestrebten Enzymkaskaden mit integrierter Kofaktor-Regeneration nutzen einfache Zuckermoleküle (z.B. Saccharose) und Polyphosphat, die aus Neben- oder Reststoffströmen nachwachsender Rohstoffe gewonnen werden können. Ablauf des Vorhabens Das BioProNuk-Projekt begann am 01.06.2022 mit der Einstellung des Doktoranden beim Partner Biomat. Die Rekrutierung von Personal bei den Partnern Biotec und ITB verzögerte sich jedoch, wodurch das Gesamtprojekt um drei bis vier Monate verspätet startete. Es wurde eine kostenneutrale Verlängerung für sechs Monate beantragt und vom Projekträger PTJ genehmigt. Die veränderte Zeitplanung für die Arbeitspakete wurde mit dem Partner ITB abgestimmt, der ebenfalls eine kostenneutrale Verlängerung beantragt hat. 3 Wesentliche Ergebnisse und Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern Zu den Herausforderungen bei der großtechnischen Produktion von Nukleotidzuckern zählen Hemmungen der Enzyme durch Zwischenproduktakkumulation, die Ausfällung von Phosphat in Anwesenheit von Magnesium und ineffiziente Enzymdosierung. Partner Biomat untersuchte die Enzymkaskade zur Synthese von UDP-GalNAc und UDP-GlcNAc. Die ATP- und UTP-Versorgung erfolgte mithilfe von Polyphosphatkinase (ChPPK) und spezifischen Kinasen. Durch Optimierung der Enzymkaskade mittels kinetischer Modellierung und Analyse der Wechselwirkung zwischen Magnesiumpolyphosphat und Enzymaktivität wurde die Produktion auf 100 mM in 200 ml skaliert. Dies führte zu 10 g UDP-GlcNAc (82,4 % Umsatz) in 48 Stunden sowie zu 12 g UDP-GalNAc (100 % Umsatz). Die Promiskuität dieser Enzymkaskade für Talose und TalNAc konnte genutzt werden, um im 5-mL-Maßstab 15,3 mg (54 % Umsatz) UDP-Tal und 13,7 mg (45 % Umsatz) UDP-TalNAc zu synthetisieren. Die vorgestellte Strategie bietet eine Grundlage für die Optimierung weiterer Enzymkaskaden zur Produktion anderer Nukleotidzucker wie GDP-Fuc. Partner Biomat optimierte diese Enzymkaskade, ATP- und GTP-Versorgung erfolgten über ChPPK. In 200 mL mit 100 mM Substrat konnten 4,5 g (40 % Umsatz) GDP-Fuc synthetisiert werden. Mit den von Partner Biotec zur Verfügung gestellten Varianten BfFKP/G76A (L-Fucokinase) und BfFKP/R592A (GDP-Fucose Pyrophosphorylase) konnte der Umsatz auf 50 % verbessert werden. Durch Austausch der PmPpa zu Polyphosphatkinase SePPK, die in der Lage ist ATP aus ADP und Pyrophosphat zu bilden, konnte die Phosphatbelastung um ein Viertel gesenkt und damit die TTN um 10 % verbessert werden. Die ATP-Regeneration wurde auch mit Pyrophosphat und Saccharose mit dem SuSy/AGPase System als proof-of-concept erreicht. Mit dem Saccharose/Polyphosphat-Regenerationssystem wurden 210 mg (37 % Umsatz) CDP-Glc synthetisiert. Für die Kaskadenenzyme wurden Expressions- und Reinigungsprotokolle etabliert. Die Expression erfolgte in E. coli BL21 (DE3), die Aufreinigung mittels IMAC/FPLC. Zur Immobilisierung wurden acht Fusionskonstrukte aus Adhäsionspeptiden (LCI, MacHis) und NahK/AGX1 generiert. Die LCI-Fusionsproteine zeigten auf MIDA/M/Ni-Harz die beste katalytische Leistung und eine Wiederverwendung der immobilisierten Enzyme war möglich. Für das Protein Engineering der Zuckerkinase NahK wurde ein robuster BCA-basierter Hochdurchsatz-Screening-Assay etabliert (CV 11,1 %, linearer Bereich 25 μM–3 mM GlcNAc), der die Identifizierung von Varianten mit potenziell verbesserter ATP-Affinität ermöglicht. Trotz vieler initialer Treffer aus epPCR und Sättigungsmutagenese konnte keine Variante mit verbesserter Kinase-Aktivität identifiziert werden. Dies deutet darauf hin, dass eine deutliche Verbesserung der NahK-Aktivität und ATP-Affinität vermutlich nur durch kombinatorische Effekte mehrerer Aminosäureaustausche erreicht werden kann. Die rationale Modifikation des bifunktionellen Enzyms FKP für die GDP-Fucose-Synthese ergab Variante G293A und Variante R809A (R592A). Damit konnten funktionell getrennte FKP-Varianten erzeugt werden. Die Kaskade für UDP-GlcNAc und UDP-GalNAc wurde an den Partner ITB übergeben und in einem Enzymmembranreaktor betrieben. In 10 mL Reaktorvolumen mit 10 mM Substrat konnte über 45 Stunden kontinuierlicher Reaktion ein space-time-yield von 39 gL-1h-1 für UDP-GlcNAc (0,4 g) erreicht werden. Herausfordernde Limitierungen im Batch sowie der kontinuierlichen Synthese waren Magnesiumverfügbarkeit als Kofaktor für die Kaskadenenzyme und die Promiskuität der Zuckerkinasen für zur Produktbildung benötigtes UTP. Diese wurden gemeinschaftlich bearbeitet und Lösungen für die optimale Ausgangskonzentration von Magnesium und Polyphosphat bestimmt und die optimale Enzymdosierung, um den UTP verbrauch der BlNahK zu reduzieren und die Produktbildung zu erhöhen.