Ultrasensitive Magnetresonanz für die Biomarkerquantifizierung - MR-BioQuant: Optimierung von Rezeptoren und Antikörpern für das BioQuantverfahren

Abstract

Im Mittelpunkt der biomedizinischen Forschung und klinischen Versorgung steht der quantitative Nachweis von Biomarkern – krankheitsrelevanten Proteinen, Pathogenen oder Zellen – der essenziell für das Verständnis systemischer Prozesse sowie für fundierte diagnostische und therapeutische Entscheidungen ist. Trotz des Einsatzes spezifischer molekularer Sensoren führen die Komplexität und Variabilität biologischer Proben häufig zu uneinheitlichen, qualitativ interpretierbaren Ergebnissen, was sowohl die Patientenversorgung beeinträchtigt als auch zusätzliche Kosten im Gesundheitswesen verursacht. Dementsprechend zielte das Projekt auf die Entwicklung einer innovativen Technologieplattform zur quantitativen Biomarkerbestimmung. Neuartige Biosensoren, die hyperpolarisiertes Xenon binden und mittels kernmagnetischer Resonanz detektiert werden, ermöglichen eine präzise Messung, die sich an die jeweilige Probenkonstitution anpasst und ohne Rückgriff auf Referenzmaterial auskommt. Durch die Ausarbeitung und Validierung auf verschiedenen Magnetresonanz-Geräteplattformen – von der Hochfeldinstrumentierung bis zu kostengünstigen Niedrigfeldgeräten – wurde der Grundstein für eine breite Anwendbarkeit in Bereichen wie Life Science Research, In-Vitro-Diagnostik, Biopharmazeutika und Magnetresonanztechnologie gelegt. Die Projektpartner der Universität Regensburg (Mikrobiologie in der Medizin, UR-Med) und (Biophysik I, UR-Bio), generierten und charakterisierten passende Moleküle für die Herstellung von Biomarkern und Biosensoren. Diese wurden dem Kooperationspartner PTB (Physikalisch-Technische Bundessanstalt) für den Test des MR-BioQuant-Verfahrens im Rahmen der hyperCEST-NMR zur Verfügung gestellt. Als Bezugsgröße hat die UR-MED Biosensor/Biomarker-Interaktion mit konventionellen Methoden quantifiziert, um Referenzwerte für die neuartigen Messungen zu erheben. Bei der Auswahl der Moleküle für Biosensoren und Biomarker fokussierte sich die UR-Med auf Impfstoff-relevante Moleküle, wie virale Oberflächenproteine, zelluläre Rezeptoren, monoklonale Antikörper und humane Seren mit nachgewiesener Serokonversion. Zur Herstellung der Biosensoren aus den vorhandenen Molekülen wurden zwei Strategien verfolgt: Einerseits die Kopplung von etablierten Xenon Käfigen, als auch die Generierung von endogenen Xe-Bindestellen in Antikörpern. Die UR-Bio stellte darüber hinaus weitere Polypeptide zur Testung der Xenon Bindung zur Verfügung: A: Das Histidine containing Protein) (HPr) von S. carnosus (1) diente als Modellprotein zur Erzeugung künstlicher xenonbindender Kavitäten in Proteinen (2,3). B: Das −Amyloidpeptid A ist ursächlich an der Entstehung der Alzheimerdemenz beteiligt. Es bildet im Gehirn Ablagerungen (Amyloid). In-vitro bilden sich diese Amyloide spontan aus A-Monomeren, die eine zentrales Forschungsthema von UR-Bio darstellen (4,5). Das rekombinant erzeugte A wurde von UR-Bio bereitgestellt. UR-Bio führte die bioinformatische Analyse der für die Experimente genutzten Biomakromoleküle durch. Hier war insbesondere die Identifizierung von Kavitäten in den Proteinen essentiell, die groß genug waren, um Xenon zu binden. Bioinformatische Analysen sagten die 129Xe-Bindungsstellen voraus, die zum Nachweis von A-Fibrillen nutzbar sein sollten. Sie identifizierten in silico mehrere mögliche intrinsische Xenonbindungsstellen (Kavitäten) in einem von UR-Med ausgewählten Modellantikörper, von denen eine experimentell mit hyperpolarisiertem und thermischen 129Xe nachgewiesen wurde (PTM) und durch Vergleich mit ähnlichen Antikörpern identifiziert wurde. Auf der Basis unserer Mutagenesedaten am HPr-Protein von S. carnosus wurden neue Xenonbindestellen für den Modelantikörper in-silico entworfen und dann gentechnisch von UR-Med integriert. Die anschließende 129Xe-NMR-Spektoskopie der modifizierten Antikörper zeigte, dass einige dieser Mutanten tatsächlich Xenon binden können. Des Weiteren wurde eine neue Messtechnik von der UR-Bio entwickelt, die die Xenonbindung in makromolekularen Komplexen erleichtern kann. Die UR-Med kann für dieses Projekt in Bezug auf die Expression und Reinigung, Qualitätskontrolle und Charakterisierung (biochemische und biophysikalische Verfahren) von rekombinanten Biomarkern und Antikörpern auf gewachsene Expertise zurückblicken. Insbesondere wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ralf Wagner Forschungsfragen zu den Themen Immunchemie (6) (16), die Herstellung von Antikörpern (7), virale Biomarker (8,9), Impfstoffentwicklung (8,10)/protein engineering (9,11,12), Kopplungschemie (11,13,14), Bindungsanalysen (15) bearbeitet. Darauf aufbauend erfolgte für MR-BioQuant die Expression und Reinigung unterschiedlicher Varianten der receptor binding domain (RBD) des SARS-CoV-2 Spike Proteins. Außerdem gelang uns die Koppelung von RBD mit Hilfe von Cystein-Maleimid Chemie an anorganische Matrizes als Basis für die Koppelung von z.B. CryA. Des Weiteren wurden für MR-BioQuant ein Sortiment von rekombinanten Antikörpern exprimiert, gereinigt und qualitätskontrolliert, um die Vorhersage endogener Xenon-Bindestelle in Biosensoren zu verifizieren und die Generierung von artifiziellen Xenon-Bindestelle zu verbessern. Für die Planung wie auch während der Durchführung des Projektes wurde durchgehend die eingängige Fachliteratur verfolgt, um die neuesten wissenschaftlichen Entwicklungen und Publikationen im Forschungsbereich des MR-BioQuant Projekts zu verfolgen. Dazu wurden die einschlägigen Plattformen wie Pubmed, Google Scholar, EspaceNet und Google Patents verwendet. Des Weiteren wurden die oben erwähnten, eigenen Arbeiten als Grundlage für das Projekt verwendet. Die zitierte Literatur ist am Berichtende zu finden. Zusammenarbeit mit anderen Stellen: In dem Projekt MR-BioQuant arbeitete die UR-Med mit den Kooperationspartnern UR-Bio und der Physikalischen Technischen Bundesanstalt eng zusammen. Die Zusammenarbeit war dabei durchwegs gut, und wurde durch regelmäßige Online-Meetings, sowie - falls notwendig - spontane ad-hoc Meetings koordiniert und abgestimmt. Diese Meetings wurden durch halbjährliche Präsenzmeetings an den Standorten Regensburg und Berlin ergänzt. Lediglich der apparativ eingeschränkte Probendurchsatz der PTB erschwerte die schnelle Adaption der Biosensor Entwicklung.