Verwertung eines in vitro Systems zum toxikologischen und metabolischen Screening von Pharmaka bei Patienten mit Fettleber (SteatoTox-2) - Teilvorhaben Primacyt, Validierung und Verstetigung des SteatoTox Kultursystems

Abstract

Die Zahl der nicht-alkoholbedingten Fettlebererkrankungen (Steatose; NAFLD - Non alcoholic fatty liver disease) in Industriestaaten ist in den letzten Jahren stark angestiegen. Steatose kann die Empfindlichkeit der Leber für toxische Wirkungen von Medikamenten und Fremdstoffen erhöhen. Im vorangegangenen Erstprojekt wurde ein in vitro System mit steatotischen (und als Kontrolle nicht steatotischen) menschlichen Hepatozyten entwickelt und prävalidiert, mit welchem Vorhersagen getroffen werden können, ob und ggf. um welchen Faktor die Suszeptibilität der steatotischen gegenüber der normalen Leber erhöht ist. Dabei diente das serumfreie Langzeitkultursystem primärer Hepatozyten der PRIMACYT GmbH als wichtige Grundlage zur Etablierung des steatotischen Kultursystems mit primären Hepatozyten. Die Verfettung der Hepatozyten erfolgte über mehrere Tage mit 558 μM freien Fettsäuren (FFA) unter gleichzeitiger Erhaltung lebender Zellen im Medium 3D-HMM. Diese steatotischen Hepatozyten in vitro sollen insofern mit der in vivo Situation möglichst vergleichbar sein, dass sie Veränderungen der Suszeptibilität der menschlichen Fettleber gegenüber Chemikalien korrekt wiedergeben. Nach der Verfettung über 5 d erfolgte die Substanzapplikation über 48 h mit Fortsetzung der bisherigen Kulturbedingungen. Die Verfettung erfolgte unter Gabe von 4 % BSA im Medium, da die meisten Substanzen eine hohe Plasmaproteinbindung (PPB) aufweisen und 4 % BSA die mittlere Albuminkonzentration des Blutes (35-55 g/L) widerspiegelt. Zur Bestimmung der Vitalität bzw. Substanztoxizität wurde der quantitative ATP-Test (Promega Cell Titer Glo) verwendet. Die Auswertung umfasste die Rohdaten der ATP-Assays, basierend auf diesen wurden die prozentualen Veränderungen der einzelnen Konzentrationen im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle jeweils für normale und verfettete Hepatozyten berechnet. Aus den Rohdaten wurden die EC50-Werte für die Substanzen berechnet und somit die Konzentrationen, die zu einer 50 %igen Toxizität in den entsprechenden Zellkulturen führten, angegeben. Basierend auf dem bei Primacyt entwickelten Hepatozyten-3D-Sphäroidmodell wurden neben der 2D-Kultur schließlich auch Versuche zur Verfettung und Toxizitätsbestimmung in 3D-Kultur durchgeführt, um Unterschiede in der Suszeptibilität zwischen 2D/3D zu untersuchen. In 3D ist außerdem eine länger andauernde Verfettung möglich. In 3D-Kulturen begann die Verfettung nach vollständigem Abschluss der Sphäroidbildung. Zur umfassenden Detektion der Toxizität einer Substanz war es außerdem wichtig, im ausgewählten Konzentrationsbereich mehrere Konzentrationen engmaschig zu applizieren, da der Einfluss der Verfettung nur bei wenigen Konzentrationen detektierbar war. Die genannten Kulturbedingungen wurden zur Verfettung von kryokonservierten humanen Hepatozyten mit anschließender Bestimmung der EC50-Konzentration für mehrere Arzneistoffe eingesetzt. Ein Schwerpunkt in diesem Projekt sollte auf dem Einsatz von primären Hepatozyten von NASH- bzw. NAFLDPatienten liegen. Die weltweite Verfügbarkeit dieser Zellen, welche auch plattierbar sein müssen, erwies sich als überaus gering. Es konnte schließlich nur mit zwei Lots gearbeitet werden, wobei die Informationen zum Donorhintergrund wenig umfangreich in Bezug auf die Fettleber waren. Bei der Auswahl der getesteten Wirkstoffe orientierte sich Primacyt, wie bereits im Erstprojekt, v. a. an der Häufigkeit der ärztlichen Verschreibung und damit Verwendung innerhalb der Bevölkerung. Es wurde die Zytotoxizität von Diclofenac, Ibuprofen und Metformin in Hepatozyten von zwei NASH-Donoren sowie in in vitro steatotischen und nicht steatotischen Hepatozyten vergleichend bestimmt. Die Applikation von Diclofenac in Hepatozyten von Fettleberpatienten deutete auf eine leichte Erhöhung des EC50-Wertes hin (Anstieg von 2,6 mM auf bis zu 4,4 mM). Ibuprofen zeigte in den NASHHepatozyten keine deutlich abweichende Toxizität im Vergleich zu normalen bzw. in vitro verfetteten Hepatozyten. Die drei Kulturen zur Toxizitätsbestimmung von MFO in Leberzellen von Fettleberpatienten wiesen im Durchschnitt eine höhere EC50-Konzentration (2,8-6,4 mM) im Vergleich zu den normalen bzw. verfetteten Hepatozyten (1-4mM) auf. Es war somit eine höhere Substanzkonzentration zum Erreichen eines toxischen Effekts erforderlich. Die 3D-Sphäroidkulturen wurden nach vollständiger Sphäroidbildung identisch zu den 2D-Kulturen mit 558 μM FFA über 5 d verfettet. Bei den NASH-Donoren erfolgte ebenfalls übereinstimmend zur 2D-Kultur keine Verfettung mit FFA, da hier von einer entsprechenden Vorbelastung ausgegangen wurde. Für Diclofenac wurden ähnliche EC50- Werte in normalen sowie NASH-Hepatozyten festgestellt. Die EC50-Werte der NASH-Zellen nach Behandlung mit Metformin wiesen eine höhere Schwankungsbreite als die der normalen Hepatozyten auf (1,8-5,8 mM). Zur Untersuchung der allgemeinen Substanztoxizität sind die 3D-Kulturen durchaus gut geeignet und haben die wichtigen Vorteile, dass zum einen deutlich weniger Zellen für die Experimente benötigt werden als bei 2D-Kulturen und diese Zellen zum anderen deutlich länger kultivierbar sind. Für angzeitkulturversuche in 2D 96well Platten erwiesen sich humane Hepatozyten aufgrund ihrer begrenzten Kultivierbarkeit von ca. 2 Wochen meist als stark limitierend. Zur Identifikation wichtiger NAFLD-Gensignaturen wurden normale humane Hepatozyten in 2D und 3D in vitro über 5 d verfettet, zu mehreren Schlüsselzeitpunkten wurden die Zellen geerntet und die RNA isoliert. Die real-time PCR-Analytik (durchgeführt bei einem Projektpartner) auf wichtige Gene der Fettsäuresynthese sowie der Fibrose zeigte einen starken Anstieg der Expression von CPT1A und FASN durch FFA. Die Expression der Procollagene Col1a2 und Col1a3 erhöhte sich in 2D-Kultur sehr stark und stieg in der Regenerationsphase weiter an, welches eher auf einen Effekt der langen Kulturdauer hinweist. Das entwickelte Zellkultursystem wurde auch als toxikologisches Readout eingesetzt, um festzustellen, ob dieses System auch zur Identifikation von Substanzen, die eine Fettleber begünstigen, geeignet ist. Es wurden nichttoxische Dosen Tetrazyklin und Dexamethason an normalen Hepatozyten für fünf bzw. acht Tage appliziert, um anschließend zelluläre Veränderungen mikroskopisch zu detektieren. Im Zuge dessen wurde erfolgreich die Bodipy-Färbung als Alternative zur Oil Red O Färbung zum Nachweis intrazellulärer Lipidvesikel etabliert und angewendet. Die Ergebnisse machten die großen Schwierigkeiten in der Langzeitkultur (bis zu 15 Tage) der normalen Hepatozyten unter FFA-Behandlung deutlich. Vor allem die Zellmorphologie des Donors BHuf16087 verschlechterte sich bereits ab Tag 5 deutlich. Auch durch die Formaldehydfixierung und mehrere Waschschritte im Rahmen der Färbung wurden die Kultur stark beeinträchtigt und einige Zellen lösten sich ab. Diese Umstände erschwerten die ohnehin sehr subjektive Auswertung der Bodipy-Färbungen nochmals. Die Unterschiede zur Lösungsmittelkontrolle 0,1 % DMSO bei Behandlung mit 0,5 mM Tetrazyklin über 5 d bzw. 8 d waren sehr gering bzw. zeigten z. T. eine stärkere Färbung von Lipidvesikeln in der Lösungsmittelkontrolle. Die Applikation von Dexamethason (DEX) zeigte nur eine minimale und kaum erkennbare Färbung der Lipidvesikel im Vergleich zur nahezu ungefärbten Lösungsmittelkontrolle 0,2 % DMSO. Bei Fixierung nach 8-tägiger Substanzapplikation war die DMSO-Kontrolle ungewöhnlich stark positiv und die DEX-Kulturen zeigten eine geringere Färbung. Im dritten Teil dieses Projektes sollten Wirkstoffe aus der präklinischen und klinischen Forschung auf ihr Potential zur NAFLD Therapie untersucht werden, wobei der Effekt v.a. bildgebend mittels Bodipy-Färbung an in vitro verfetteten Hepatozyten erfasst wurde. Die Substanz Obeticholsäure zeigte im Tiermodell eine Reduktion der Insulinresistenz und der hepatischen Steatose. Normale Hepatozyten wurden fünf Tage mit FFA verfettet und anschließend über drei/sechs/neun Tage mit Obeticholsäure behandelt. Die Bodipy-Färbungen der normalen Hepatozyten zeigten keinen deutlichen Rückgang der Lipidvesikel nach Substanzgabe. Meist führte auch bereits 0,1 % DMSO als Lösungsmittelkontrolle zu weniger Lipidvesikeln in den Zellen. Zum Teil auch aufgrund der langen Kulturdauer von bis zu 15 d wiesen die Kulturen eine unterschiedliche Konfluenz zwischen den Bedingungen auf, welches die Beurteilung zusätzlich erschwerte. Die Zellen des NASH-Donors H1249 wiesen zu Beginn der Behandlung keine Lipidvesikel auf, so dass somit auch die Beurteilung eines Rückgangs des intrazellulären Fettes nicht möglich war. Die in vitro Gabe von FFA regte die Bildung von Lipidvesikeln an, die anschließende Applikation von 12,5 μM OCA über 6 d führte zu einem Rückgang der Lipidvesikel in den Zellen und somit zu einer weniger starken Bodipy-Färbung. Die hier zusammengefassten Ergebnisse bestätigen (in geringem Umfang) eine leicht erhöhte Suszeptibilität steatotischer Hepatozytenkulturen im Vergleich zu unbehandelten Kulturen. Es wurden erfolgreich zwei Langzeitkultursysteme (2D, 3D) entwickelt, bei denen humane Hepatozyten in einen steatotischen Zustand versetzt werden und anschließend zur Untersuchung der Arzneimittelsuszeptibilität verwendet werden können. Die Suszeptibilität gegenüber Wirkstoffen in 3D-Kultur war höher als in 2D-Kultur, wodurch die Sphäroidkultur ein höheres Potential als die 2D-Kultur in der Weiterentwicklung und zukünftigem Einsatz der in vitro Systeme hat. In Sphäroidkultur ist außerdem eine deutlich längere Exposition der Zellen gegenüber steatotischen Bedingungen wahrscheinlich möglich. Für weiterführende Arbeiten im Rahmen der Fragestellungen sind auf jeden Fall mehrere Lots mit Hepatozyten von NASH-Donoren erforderlich. Tiefergehende Untersuchungen scheiterten bereits in diesem Projekt an der weltweit sehr geringen Verfügbarkeit plattierbarer Leberzellen von NASH-Patienten. Diese ist sehr wahrscheinlich in der schlechten Isolierbarkeit vitaler Zellen aus NASH-Lebern bedingt. Bei der Entwicklung von NAFLD zu NASH werden auch hepatische Sternzellen und Kupfferzellen aktiviert. Daher ist es zur Verbesserung des Systems erforderlich, das bestehende System um diese zwei Leberzelltypen zu erweitern und die hier generierten Daten mit dem komplexeren Leberzellmodell zu vergleichen. Das entwickelte 2D- und 3DTestsystem zur Untersuchung der Suszeptibilität steatotischer Hepatozyten gegenüber Wirkstoffen hat einen sehr hohen Nutzen für Arbeiten im Rahmen der Arzneimittelentwicklung und kann bereits helfen, unterschiedliche Empfindlichkeiten zu detektieren. Dennoch sind weitere Forschungen, z. B. in Bezug auf die Genexpression der steatotischen Zellen im Vergleich zu NAFLD-Patienten und die weitere Komplexierung mit nichtparenchymalen Leberzellen nötig.

The incidence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in developed countries has risen sharply in recent years. Steatosis can increase the sensitivity of the liver to toxic effects of drugs and xenobiotics. In the preceding first project, an in vitro system with steatotic (and as a control non-steatotic) human hepatocytes was developed and pre-validated, to predict whether and by which factor the susceptibility of the steatotic versus normal liver is increased. The serum-free long-term culture system of primary hepatocytes from PRIMACYT GmbH served as an important basis for the establishment of the steatotic culture system with primary hepatocytes. Hepatocyte steatosis was induced by 558 μM free fatty acids (FFA) for several days while maintaining living cells in the medium 3D-HMM. These in vitro steatotic hepatocytes should be as comparable as possible to the in vivo situation in that they correctly reflect changes in the susceptibility of the fatty human liver to chemicals. After 5 d of steatosis, the substance was applied for 48 h maintaining the previous culture conditions. Fatty degeneration was performed with the administration of 4 % BSA in the medium because most substances have a high plasma protein binding (PPB) and 4 % BSA reflects the mean albumin concentration of the blood (35-55 g/L). The quantitative ATP assay (Promega Cell Titer Glo) was used to determine viability and compound toxicity. The raw data from the ATP assays were used to calculate the percentage change in each concentration compared to the solvent control for normal and fatty hepatocytes. The EC50 values for the compounds were calculated from the raw data, indicating the concentrations that produced 50 % toxicity in the corresponding cell cultures. Based on the 3D hepatocyte spheroid model developed at Primacyt, fatty degeneration and toxicity tests were performed in 3D culture in addition to 2D culture to investigate differences in susceptibility between 2D/3D. In 3D, longer lasting steatosis is also possible. In 3D cultures, fatty degeneration began after spheroid formation was complete. In order to comprehensively detect the toxicity of a substance, it was also important to apply several concentrations in the selected concentration range in a dense manner, as the influence of fatty degeneration could only be detected at a few concentrations. The mentioned culture conditions were used for the fatty degeneration of cryopreserved human hepatocytes with subsequent determination of the EC50 concentration for several drugs. One focus of this project was the use of primary hepatocytes from NASH and NAFLD patients. The worldwide availability of these cells, which must also be platable, proved to be extremely limited. In the end, it was only possible to work with two batches, and the donor background information was not very comprehensive with respect to fatty liver. As in the first project, Primacyt selected the compounds to be tested primarily on the basis of the frequency of prescription and thus use in the population. The cytotoxicity of diclofenac, ibuprofen and metformin was determined comparatively in hepatocytes from two NASH donors and in in vitro steatotic and non-steatotic hepatocytes. The application of diclofenac in hepatocytes from patients with fatty liver resulted in a slight increase of the EC50 value (increase from 2.6 mM to up to 4.4 mM). Ibuprofen showed no significantly different toxicity in NASH hepatocytes compared to normal or in vitro fatty hepatocytes. The three cultures used to determine the toxicity of MFO in hepatocytes from patients with fatty liver disease showed on average a higher EC50 concentration (2.8-6.4 mM) compared to normal or fatty hepatocytes (1-4 mM). Thus, a higher concentration of compound was required to produce a toxic effect. After complete spheroid formation, the 3D spheroid cultures were lipidated with 558 μM FFA for 5 d, identical to the 2D cultures. In the NASH donors, no lipidation with FFA was performed, also in agreement with the 2D culture, as a corresponding preload was assumed. Similar EC50 values were found for diclofenac in normal and NASH hepatocytes. The EC50 values of NASH cells after treatment with metformin showed a higher range than those of normal hepatocytes (1.8-5.8 mM). For the investigation of general substance toxicity, 3D cultures are well suited and have the important advantages that significantly fewer cells are required for experiments than in 2D cultures and that these cells can be cultured for much longer periods. For long-term culture experiments in 2D 96-well plates, human hepatocytes usually proved to be very limiting due to their limited cultivability of about 2 weeks. To identify important NAFLD gene signatures, normal human hepatocytes were lipidized in vitro in 2D and 3D for 5 d, cells were harvested at several key time points and RNA was isolated. Real-time PCR analysis for key fatty acid synthesis and fibrosis genes showed a strong increase in the expression of CPT1A and FASN by FFA. Expression of the procollagen genes Col1a2 and Col1a3 increased very strongly in 2D culture and increased further in the regeneration phase, indicating rather an effect of the long culture period. The developed cell culture system was also used as a toxicological readout to determine if this system is also suitable for identifying substances that promote fatty liver. Non-toxic doses of tetracycline and dexamethasone were applied to normal hepatocytes for five and eight days, respectively, and cellular changes were detected microscopically. Bodipy staining was successfully established as an alternative to Oil Red O staining for the detection of intracellular lipid vesicles. The results showed major difficulties in long-term culture (up to 15 days) of normal hepatocytes under FFA treatment. In particular, the cell morphology of donor BHuf16087 deteriorated significantly from day 5. The culture was also severely affected by formaldehyde fixation and multiple washing steps during staining, and some cells detached. These circumstances made the already very subjective evaluation of the Bodipy staining even more difficult. The differences to the solvent control 0.1% DMSO when treated with 0.5 mM tetracycline for 5 d or 8 d were very small, and in some cases showed stronger staining of lipid vesicles in the solvent control. Dexamethasone application showed minimal and barely detectable staining of lipid vesicles compared to the almost unstained solvent control 0.2% DMSO. When fixed after 8 days of drug application, the DMSO control was unusually strong positive and the DEX cultures showed less staining. In the third part of the project, compounds from preclinical and clinical research will be evaluated for their potential in NAFLD therapy, primarily using Bodipy staining of in vitro adipose hepatocytes. Obeticholic acid has been shown to reduce insulin resistance and hepatic steatosis in animal models. Normal hepatocytes were lipidized with FFA for five days and then treated with obeticholic acid for three/six/nine days. Bodipy staining of normal hepatocytes showed no significant decrease in lipid vesicles after substance administration. In most cases, even 0.1% DMSO as a solvent control resulted in fewer lipid vesicles in the cells. Partly due to the long culture time of up to 15 days, the cultures showed different confluences between the conditions, which further complicated the evaluation. Cells from the NASH donor H1249 did not show any lipid vesicles at the beginning of the treatment, so it was not possible to assess a decrease in intracellular fat. The in vitro application of FFA stimulated the formation of lipid vesicles, the subsequent application of 12.5 μM OCA for 6 d led to a decrease of lipid vesicles in the cells and thus to a less intense Bodipy staining. The results summarized here confirm (to a small extent) a slightly increased susceptibility of steatotic hepatocyte cultures compared to untreated cultures. Two long-term culture systems (2D, 3D) have been successfully developed in which human hepatocytes are placed in a steatotic state and then used to study drug susceptibility. The drug susceptibility in 3D culture was higher than in 2D culture, which means that spheroid culture has a higher potential than 2D culture for further development and future use of in vitro systems. It is also likely that spheroid culture allows for significantly longer exposure of cells to steatotic conditions. In any case, several batches of hepatocytes from NASH donors will be required for further work in the context of the research questions. Further studies in this project have already failed due to the very low availability of platable liver cells from NASH patients worldwide. This is most likely due to the poor isolation of vital cells from NASH livers. During the progression from NAFLD to NASH, hepatic stellate cells and Kupffer cells are also activated. Therefore, to improve the system, it is necessary to expand the existing system to include these two liver cell types and compare the data generated with the more complex liver cell model. The 2D and 3D test system developed to investigate the susceptibility of steatotic hepatocytes to drugs is very useful for drug development work and can already help to detect different sensitivities. However, further research is needed, e.g. regarding the gene expression of steatotic cells in comparison to NAFLD patients and further complexation with non-parenchymal liver cells.