Verbundvorhaben: Plattform zur selektiven Herstellung von funktionalisierten Polyalkoholen aus nachwachsenden Rohstoffen über Biooxidationen - Teilvorhaben 2 (Mikrobiologie) - Akronym: PolyBioOx-MB

Abstract

Projektbeschreibung: Zielsetzung des PolyBioOx-Vorhabens war es, eine neue, flexible und skalierbare Produktionsplattform (vom Biokatalysator über den Bioreaktor zum Bioprozess) zur effizienten Gewinnung von funktionalisierten Polyalkoholen aus nachwachsenden Rohstoffen für vielfältige, auch großvolumige industrielle Anwendungen zu entwickeln. Als Edukte sollten Polysaccharid-Abbauprodukte aus pflanzlicher Biomasse (Cellobiose, Galakturonsäure, Galaktitol, Cellooligosaccharide, Xylitol, Xylooligosaccharide) verwendet und in einstufigen Oxidationen durch membranständige Dehydrogenasen (mDH) regioselektiv zu funktionalisierten Polyalkoholen unter Erreichung hoher Produktkonzentrationen und möglichst vollständiger Ausbeute oxidiert werden. Die Ziele des PolyBioOx-Vorhabens sollten durch die enge Kooperation der beteiligten Arbeitsgruppen der beiden Teilvorhaben Mikrobiologie und Bioverfahrenstechnik erreicht werden. Auf der Grundlage des osmotoleranten Essigsäurebakteriums Gluconobacter oxydans sollten mit gentechnischen Methoden maßgeschneiderte Ganzzellbiokatalysatoren hergestellt werden, in denen Gene für ausgewählte mDHs exprimiert werden. Die von der Mikrobiologie entwickelten Biokatalysatoren sollten dann in Kooperation mit dem Projektpartner (Bioverfahrenstechnik) unter kontrollierten Bedingungen reaktionstechnisch charakterisiert und optimierte Oxidationsprozesse im Bioreaktor etabliert werden. Projektergebnisse: Im Verlauf des Projekts gelang es, alle wesentlichen beantragten Punkte umzusetzen. Der Stamm G. oxydans BP9.1, dessen eigene membranständige Dehydrogenasen (mDHs) deletiert wurden, konnte als versatile Expressionsplattform für Gene für mDHs etabliert werden. In den entwickelten Stämmen wird durch Einführung entsprechender Gene für homologe oder heterologe mDHs immer lediglich eine mDH gebildet. Die entwickelten, auf G. oxydans BP9.1 basierten Expressionsstämme sind äußerst osmotolerant und daher mit hohen Substrat- und Produktkonzentrationen einsetzbar. Um die Vielseitigkeit der Plattform zur Oxidation verschiedener Substrate zu biotechnologisch relevanten Produkten zu demonstrieren, wurden erfolgreich geeignete mDHs für die Oxidation von Cellobiose zu Cellobionsäure, von Galakturonsäure zu Galaktarsäure, von Galaktitol zu Tagatose, von Xylitol zu Xylulose, und von Cello- und Xylooligosacchariden zu den korrespondierenden Onsäuren identifiziert. Besonders erfolgreich verlief die Bereitstellung eines G. oxydans Stamms mit exprimierter membranständiger Glukosedehydrogenase aus Pseudomonas taetrolens für die Oxidation des Disaccharids Cellobiose zu Cellobionsäure. Beim Kooperationspartner Bioverfahrenstechnik wurde damit in Wachstums-entkoppelten Biotransformationen bei einer Cellobiose-Konzentration deutlich über der Löslichkeitsgrenze in einfachen Satzverfahren Cellobionsäure-Konzentrationen von über 500 g L-1 bei stöchiometrischer Ausbeute erzielt. Ebenfalls erfolgreich wurden G. oxydans Ganzzellbiokatalysatoren für die Oxidation von Galakturonsäure zu Galaktarsäure erprobt, wenngleich nicht so hohe Produktkonzentrationen erreicht werden konnten, wie bei der Cellobionsäuresynthese. Project objective: The aim of the PolyBioOx project was to develop a new, flexible and scalable production platform (from biocatalyst to bioreactor to bioprocess) for the efficient production of functionalized polyalcohols from renewable raw materials for a wide range of industrial applications, including large-volume applications. Substrates derived from polysaccharides from plant biomass (cellobiose, galacturonic acid, galactitol, cellooligosaccharides, xylitol, xylooligosaccharides) should be used as starting materials. The substrates should be oxidized regio-selectively in one-step oxidations by membrane-bound dehydrogenases (mDH), to yield functionalized polyalcohols at high product concentrations and as complete a yield as possible. The objectives of the PolyBioOx project were to be achieved through close cooperation between the working groups involved in the two sub-projects Microbiology and Bioprocess Engineering. Based on the osmotolerant acetic acid bacterium Gluconobacter oxydans, genetic engineering methods should be used to produce customized whole-cell biocatalysts in which genes for selected mDHs are expressed. The biocatalysts developed by the sub-project Microbiology should then be characterized under controlled conditions in cooperation with the project partner Bioprocess Engineering to establish optimized oxidation processes in bioreactors. Project results: Over the course of the project, all of the essential points listed in the proposal were successfully addressed. The G. oxydans BP9.1 strain, whose own membrane dehydrogenases (mDHs) were deleted, was established as a versatile expression platform for mDH genes. By introducing selected genes for homologous or heterologous mDHs, only one mDH is ever produced in the developed strains. The developed G. oxydans BP9.1-based expression strains are extremely osmotolerant and therefore are able to cope with high substrate and product concentrations during oxidative fermentations. To demonstrate the versatility of the platform for the oxidation of various substrates into biotechnologically relevant products, suitable mDHs were successfully identified for the oxidation of cellobiose to cellobionic acid, galacturonic acid to galactaric acid, galactitol to tagatose, xylitol to xylulose, and cello- and xylooligosaccharides to the corresponding onoic acids. The development of a G. oxydans strain expressing membrane-bound glucose dehydrogenase from Pseudomonas taetrolens for the oxidation of the disaccharide cellobiose to cellobionic acid was particularly successful. The cooperation partner Bioprocess Engineering achieved cellobionic acid concentrations of over 500 g L-1 with stoichiometric yield in growth-decoupled biotransformations at a cellobiose concentration well above the solubility limit in simple batch processes. G. oxydans whole-cell biocatalysts for the oxidation of galacturonic acid to galactaric acid were also successfully tested, although the product concentrations reached were not as high as in cellobionic acid production.