KMU-innovativ Verbundprojekt: Vorhersage der individuellen Immunreaktion auf Organtransplantate (iimOzell) - Teilprojekt: Anwendung des Tests auf Spendermaterial unterschiedlicher Organe und Validierung

Abstract

Das Verbundprojekt „iimOzell“ (FK: 13GW0500B) befasste sich mit der Entwicklung eines Endothelzell-basierten Donor-spezifischen ELISpots und dessen Einsatzmöglichkeit zur Vorhersage der individuellen Immunreaktion auf Organtransplantate. Dies sollte als Grundlage dafür dienen, die Behandlungserfolge der Immunsuppression, die eine Abstoßung des Organs verhindern soll, zu optimieren und Nebenwirkungen zu minimieren. Die Reaktion des Immunsystems eines Organempfängers ist maßgeblich verantwortlich für die Organabstoßung nach Transplantation. Eine wichtige Bedeutung kommt dabei den T-Lymphozyten des Empfängers zu. Sie vermitteln die akute Abstoßung und tragen außerdem zur Aktivierung von B-Zellen und der Bildung von Antikörpern bei, was wiederum chronische Transplantatverluste verursacht. Um eine Organabstoßung und Transplantatverluste zu verhindern, bedarf es einer immunsuppressiven Therapie, welche aber mit erheblichen unerwünschten Nebenwirkungen verbunden ist. Daher wäre eine individuell auf den Patienten abgestimmte Immunsuppression wünschenswert, die den individuell notwendigen Anforderungen, nach dem Motto: “So viel wie nötig und so wenig wie möglich“, genügen würde. Bisher existieren jedoch keine geeigneten Testmethoden, um die Immunreaktion umfassend und unter den vorhandenen Rahmenbedingungen ermitteln zu können. Ein weiteres Problem ist, dass im Verlauf nach Transplantation kein geeignetes Spendermaterial zur Verfügung steht, um die spenderspezifische Immunreaktivität des Empfängers unter Immunsuppression erneut überprüfen zu können. Im Rahmen des Verbundprojektes wurde hierfür in Zusammenarbeit mit dem Projektpartner GenID GmbH (Straßberg/Deutschland) ein neuartiger Test auf Basis eines ELISpots erforscht, der erstmalig eine quantitative Analyse der Immunantwort des Empfängers auf das Spenderorgan ermöglichen sollte und so die Grundlage für die individualisierte, genau auf den Patienten abgestimmte immunsupprimierende Therapie, bieten sollte. Es sollte ein Mehrfarben-ELISpot entwickelt und eingesetzt werden, der nach Stimulation von T-Lymphozyten des Empfängers mit Endothelzellen aus dem transplantierten Organ, für die Immunreaktion relevante Zytokine messen sollte. Die Innovation des Testverfahrens bestand dabei in der Anwendung geeigneter Zytokine (z.B. IL-2, IFN-g und IL-5) und der Stimulation mittels Endothelzellen, die in der soliden Organtransplantation der erste Kontakt zwischen Spenderorgan und Empfänger sind. Es wurde daher davon ausgegangen, dass die Aussagekraft der Testergebnisse höher sein würde, als beim Einsatz von Spender-Leukozyten aus der Milz oder dem Blut. Im Verlauf des Projektes konnten die Techniken der Isolierung, der Kultivierbarkeit und der Lagerung von humanen, aus Blutgefäßen des Transplantats isolierten, Endothelzellen erfolgreich etabliert werden. Endothelzellen konnten bis zu einem Zeitraum von 4 Tagen nach Transplantation erfolgreich aus Blutgefäßen des Transplantats isoliert werden. Da Transplantationen häufig nachts oder am Wochenende stattfinden und nicht davon auszugehen ist, dass alle Transplantationszentren die Ressourcen haben, nachts und am Wochenende Personal zu akquirieren, ist es mit unserer Methode möglich, spenderspezifische Zellen am nächsten Werktag nach der Transplantation erfolgreich zu isolieren. Dies zeigt das große Potential der Nutzung von Endothelzellen als spenderspezifische Stimulatorzellen, da im Vergleich zu Versuchsansätzen in denen Milzzellen des Spenders bzw. Blutzellen als Stimulatorzellen genutzt wurden, diese aufgrund der geringen Haltbarkeit, zügig nach der Transplantation isoliert werden müssen. Die Endothelzellen konnten längerfristig konserviert werden (> 1 Jahr), so dass eine Durchführung des Tests im Verlauf nach Transplantation, z.B. nach drei, sechs und zwölf Monaten gewährleistet war. Somit war eine weitere wichtige Voraussetzung für die Entwicklung eines neuartigen spenderspezifischen Testsystems erfüllt. Eine Reinheit der Endothelzellen von >95% konnte nach immunomagnetischer Separation mit Hilfe anti-CD31 Antikörper-gekoppelten magnetischen Beads erzielt werden. Die Endothelzellen wurden phänotypisch charakterisiert und auf die Expression CD31, HLA-I und HLA-II untersucht. Endothelzellen exprimieren in vitro kein HLA-I/-II. HLA-Moleküle konnten jedoch durch Stimulation mit IFN-g (50 ng/ml, 96h) induziert werden. Somit war die Voraussetzung gegeben, dass Endothelzellen in vitro Antigen präsentieren und Lymphozyten aktivieren können. Der vom Projektpartner GenID entwickelte und der Unimedizin Mainz zur Verfügung gestellte Mehrfarben-ELISpot wurde mit Spenderzellen aus der Milz bzw. mit allogenen PBMCs erfolgreich validiert. Eine Aktivierung von Lymphozyten konnte über die die Detektion von IL-2- und IFN-g-sezernierender Zellen nachgewiesen werden. IL-5-sezernierende Zellen konnten nicht detektiert werden. Deswegen haben wir uns im Verlauf des Projektes entschieden, die Etablierung des Testsystems mit Endothelzellen auf den Zweifarben-ELISpot (IL-2/IFN-g) zu beschränken. Die Übertragung des spenderspezifischen ELISpots auf Endothelzellen erwies sich als nicht möglich. In keinem unserer Versuchsansätze konnte im ELISpot eine Aktivierung von allogenen Lymphozyten durch Endothelzellen nachgewiesen werden. Dies gelang uns aber mit einem alternativen Testsystem, einem ‚High Sensitivity‘ ELISA. In einem Stimulationsansatz mit Endothelzellen als Stimulatorzellen und allogenen Lymphozyten als Responderzellen konnten im Kulturüberstand IL-2 und IFN-g nachgewiesen werden. Eine anschließende Beobachtungsstudie soll nun zeigen, ob die Quantifizierung von IL-2 und IFN-g im ELISA ein Maß für die spender-spezifische Immunreaktivität/-suppression im Verlauf nach Organtransplantation dienen kann. Gleichzeitig verfolgen wir in einem ZIM-geförderten Anschlussprojekt mit GenID als Projektpartner einen spender-unabhängigen Stimulationsansatz mit dem ELISpot als Detektionssystem. Somit haben wir zwei vielversprechende Testsysteme zur Verfügung, um ein Testsystem zu finden, das die Immunreaktivität von Organempfängern nach Transplantation messen kann und im klinischen Alltag genutzt werden könnte.