KMUi-BÖ02: SiaHMO - Erforschung eines effizienten, zellfreien Herstellverfahrens komplexer, sialylierter HMO als präbiotischer Nahrungsmittelzusatz; Teilprojekt 2: Entwicklung von Enzymkaskaden zur Regeneration von ATP in zellfreien Reaktionssystemen

Abstract

Das Projekt SiaHMO hatte die Herstellung sialylierter humaner Milch-Oligosaccharide (HMO) zum Ziel. Neben der Konstruktion von Enzymkaskaden zur Herstellung der Oligozucker war die Entwicklung eines zellfreien Enzymsystems zur Regeneration von Adenosintriphosphat (ATP) ein Hauptziel im Projekt. Für diesen Projektteil war die Professur für Bioverfahrenstechnik an der TU Dresden zuständig. Die Ergebnisse für diesen Projektteil werden im vorliegenden Bericht beschrieben. Über die Herstellung von HMOs hinaus, sind ATP-abhängige in vitro Bioprozesse, wie die zellfreie Proteinsynthese oder die Herstellung phosphorylierter Feinchemikalien, von erheblicher industrieller Bedeutung. Ihre Umsetzung wird jedoch hauptsächlich durch die hohen Kosten von ATP behindert. Wir haben ein zellfreies ATP-Regenerationssystem vorgeschlagen, das auf der in-situ-Generierung der energiereichen Verbindung Acetylphosphat (AcP) aus kostengünstiger D-Fructose- und anorganischem Phosphat basiert, und haben in diesem Projekt dessen Machbarkeit demonstriert. Die Enzymkaskade verkettet die Aktivitäten von D-Fructose-Phosphoketolase, D-Erythrose-Isomerase, D-Erythrulose-Phosphoketolase und Glycolaldehyd-Phosphoketolase und ermöglicht so theoretisch die Produktion von 3 mol ATP pro mol D-Fructose. Durch einen semi-rationalen Engineering-Ansatz und das Screening von neun Einzelmutationsbibliotheken optimierten wir die Phosphoketolase (PKT) aus Bifidobacterium adolescentis und identifizierten die Variante Bad.Pkt H548N. Diese Mutante zeigte eine 5,6-fache Steigerung der D-Fructose-Aktivität, eine 2,2-fache Steigerung der D-Erythrulose-Aktivität und eine 1,3-fache Steigerung der Glykolaldehyd-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Enzym. Die Bad.Pkt H548N-Mutante wurde zunächst in einem zellfreien Reaktionssystem zusammen mit einer Acetat-Kinase aus Geobacillus stearothermophilus und einer Glycerin-Kinase aus Cellulomonas sp. zur Herstellung von Glycerin-3-Phosphat aus ADP und Glycerin eingesetzt. Wir demonstrierten die Durchführbarkeit der ATP-Regeneration aus 25 mM D-Fructose mit einer Stöchiometrie von 1 Mol ATP pro Mol C6-Ketose. Anschließend wurde das Reaktionssystem durch Einbeziehung der D-Erythrose-Isomerase-Aktivität, die von einer L-Rhamnose-Isomerase aus Pseudomonas stutzeri bereitgestellt wird, verbessert. In dem vollständigen System stieg die ATP-Ausbeute auf 2,53 mol pro Mol verbrauchter Fructose bei einer maximalen Produktivität von 7,2 mM h-1.