Untersuchung schneller biochemischer Prozesse bei der Gravitaxis sowie der Interaktion mit der Phototaxis von Euglena gracilis (EuGraviLight)

Abstract

Im Projekt wurden die mechanistischen Grundlagen der licht- und beschleunigungsabhängigen cAMP-Regulation in Euglena gracilis untersucht. Durch Optimierung der ultraschnellen Fixierung und der quantitativen cAMP-Bestimmung konnte gezeigt werden, dass der lichtinduzierte cAMP-Anstieg extrem kurzlebig ist: Bereits 100 ms nach Dunkelheit fällt der cAMP-Spiegel nahezu auf Ausgangsniveau zurück. Diese sehr schnelle Dynamik ist zentral für die zeitliche Kopplung von Photo- und Gravitaxis. Die Rolle der phototaktischen Adenylatzyklasen PACα und PACβ wurde mittels CRISPR-Cas9-Mutanten eindeutig bestätigt. Alle Knockout-Linien, bei denen PAC-Gene ausgeschaltet wurden, zeigten keinerlei cAMP-Erhöhung mehr nach Beleuchtung. Damit ist die PAC-abhängige Phototransduktion als einzige Quelle des lichtabhängigen cAMP-Anstiegs identifiziert. Die Parabelflugexperimente ermöglichten erstmals eine kombinierte Analyse von Licht- und Beschleunigungseinflüssen unter realer Mikrogravitation. Beschleunigungsänderungen modulier­ten den cAMP-Gehalt signifikant: Zwischen 1 g und µg wurde ein deutlicher Unterschied festgestellt, während 1 g und 1,8 g ähnliche Werte zeigten. Unter Licht traten diese Effekte abgeschwächt auf. Kinetische Messungen ergaben, dass kurze Lichtpulse bereits zu einem cAMP-Anstieg führen, der während anschließender Dunkelphasen innerhalb von Sekunden abklingt. Klinostatenversuche erzeugten dagegen keine nennenswerte Änderung des cAMP-Spiegels, was die Notwendigkeit realer Beschleunigung für die Aktivierung mechanosensitiver Strukturen unterstreicht. Ein zweiter Schwerpunkt war die bioinformatische Identifikation gravitaxisrelevanter Adenylatzyklasen, die potenziell durch Calmodulin 2 aktiviert werden könnten. Mithilfe einer neu entwickelten Pipeline wurden mehrere AC-Kandidaten mit hoher vorhergesagter CaM2-Bindungsaffinität identifiziert. Erste CRISPR-Cas9-Knockouts dieser Kandidaten zeigten deutliche Veränderungen im gravitaktischen und phototaktischen Verhalten, was deren funktionelle Bedeutung stützt. Die neu entwickelte Software zur Zuordnung von cDNA- und gDNA-Sequenzen verbessert zudem die Präzision zukünftiger CRISPR-Eingriffe erheblich.