AAVs for genetic manipulation of cardiovascular phenotypes

Abstract

Zirkuläre RNAs gehören zur Klasse der nicht-kodierenden RNAs, denen vielfältige Funktionen wie die Bindung von Mikro-RNAs bzw. RNA-bindenden Proteinen sowie Regulation der Transkription oder Translation zugeschrieben werden. Für eine Funktionsanalyse sowie in vivo Manipulation von zirkulären RNAs sind spezifische zirkuläre RNA Überexpressions- bzw. Knockdown Ansätze von entscheidender Bedeutung. In vivo Expressionssysteme basierend auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) werden für eine schnelle und effiziente Überexpression von RNAs in verschiedenen Zielgeweben/Zelltypen verwendet. Im Kontext von AAV-vermittelten zirkulären RNA-Überexpressionssystemen bieten sich zwei Ansätze an, die auf unterschiedlichen Mechanismen beruhen: eine enzymatisch-basierte RNA-Zirkularisierung (Tornado-System) sowie eine rückwärtsgerichtete Spleißmethode (ZSCAN1-basiert), die beide bislang nicht miteinander verglich wurden. AAV-basierte Knockdowns von linearen mRNAs sowie zirkulären RNAs (circRNAs) mit Hilfe von shRNA-Ansätzen sind nach wie vor äußerst ineffizient. Neuere Studien haben gezeigt, dass CRISPR-RfxCas13d durch die Verwendung spezifischer Guide RNAs, welche gegen einzigartige Sequenzen der zirkulären RNA gerichtet sind, diese spezifisch spaltet, wohingegen lineare mRNAs intakt bleiben. Die Fusion von Cas13d mit einer Kernlokalisation-Sequenz (NLS) bzw. einer Kernexport-Sequenz (NES) ermöglicht theoretisch den gezielten Abbau von linearen bzw. zirkulären RNAs in den jeweiligen zellulären Kompartimenten. Die Ziele des Vorhabens wurden wie folgt definiert: 1. Etablierung einer AAV9-vermittelten zirkulären RNA Überexpression im Herzen 2. Design und Vortest von einzelnen und kombinierten Cas13d guides 3. In vivo Applikationen von Cas13d vermittelter Eliminierung von zirkulärer RNA