CORONA - VirAn-Verbundvorhaben: Hochdurchsatzfähige Multiplex Bead Assays; TP2 - Attomol: Neue Solid-Phase-Beadassays (SBA) für die Multiplex-Messung von Antikörpern und Entzündungsmediatoren bei der Diagnostik virusbedingter respiratorischer Erkrankungen

Abstract

Die SARS-Cov2-Pandemie führte zu einem enormen Bedarf an schnellen und empfindlichen Virus-Nachweisen, wie Antigen-Schnelltests und PCR-Tests, um infizierte Personen sicher erkennen zu können und durch Quarantäne zu isolieren. Antikörpernachweise spielten hierbei eine untergeordnete Rolle, da die Infektiösität der Patienten vor Bildung der Antikörper bereits sehr hoch ist. Bei z.B. längeren Verlaufsformen, dem Long-COVID, oder bei ungewöhnlich starken Erkrankungen bei Kindern rückte das immunologische Geschehen bei der Immunantwort der Patienten in den Fokus der klinischen Forschung, wie z.B. die sogenannten Interleukin-Stürme, die zu lebensbedrohlichen akuten Situationen führen können. Doch das Bild von COVID ist sehr vielfältig und oft lassen sich vergleichsweise unspezifische Symptome wie Müdigkeit nur schwer mit der SARS-Cov-2-Infektion assoziieren. Auch hier kann der Nachweis von Antikörpern helfen, wenn das Virus selbst bereits nicht mehr nachweisbar ist. Das vorliegende Projekt von Attomol hatte zum Ziel für die klinische Forschung ein Testsystem zu entwickeln, welches nicht nur Anti-SARS-Cov2-Antikörper im Multiplexformat in Patientenserum nachweisen kann, sondern als zusätzliche Information auch Aussagen zur Bindungsstärke dieser Antikörper liefert. Aus diesem Grund entwickelten wir für die Beadassay-Technologie von Attomol eine neue und mittlerweile zum Patent angemeldete Technologie zur Bestimmung von Antikörperschmelzkurven, aus denen die Antikörperschmelztemperaturen abgeleitet werden. Je höher die Schmelztemperatur, umso größer ist die Bindungsstärke der Antikörper. Das Verfahren der Antikörperschmelzkurven-Bestimmungen sollte ebenso für die Einzelmoleküldetektion von Antikörpern entwickelt werden. Zunächst wurde ein Antikörper-Beadassay für den Nachweis von SARS-Antikörpern entwickelt und getestet. Nach dem Erreichen einer ausreichenden Sensitivität und Spezifität des Testsystems im Vergleich zum Anti-SARS-ELISA wurde die Auswerteplattform der Beadassays, der Caleidosan 300, verwendet, um die im Antikörper-Beadassay gebundenen Anti-SARS-Antikörper von deren spezifischen Sensor-Molekülen (SARS-Cov2-Antigene) thermisch abzulösen. Es konnten sehr unterschiedliche Schmelztemperaturen und Schmelzkurvenformen bei verschiedenen Seren und rekombinante Antikörper festgestellt werden. Datei-Upload durch TIB The SARS-Cov2 pandemic led to an enormous need for rapid and sensitive virus detection, such as rapid antigen tests and PCR tests, in order to reliably recognise infected persons and isolate them through quarantine. Antibody detection plays a subordinate role here, as the infectiousness of patients is already very high before antibodies are formed. In the case of longer courses of the disease, e.g. long-COVID, or unusually severe illnesses in children, the immunological events in the patient's immune response became the focus of clinical research, such as the so-called interleukin storms, which can lead to life threatening acute situations. However, the picture of COVID is very diverse and it is often difficult to associate comparatively non-specific symptoms such as fatigue with SARS-Cov-2 infection. Here, too, the detection of antibodies can help if the virus itself is no longer detectable. The aim of this Attomol project was to develop a test system for clinical research that can not only detect anti-SARS-Cov-2 antibodies in multiplex format in patient serum, but also provides additional information on the binding strength of these antibodies. For this reason, we developed a new and now patent-pending technology for Attomol's bead assay technology to determine antibody melting curves from which the antibody binding strength can be determined. The higher the melting temperature, the greater the binding strength of the antibodies. The method of determining antibody melting curves was also to be developed for the single-molecule detection of antibodies. Firstly, an antibody bead assay was developed and tested for the detection of SARS antibodies. After achieving sufficient sensitivity and specificity of the test system compared to the anti-SARS ELISA, the evaluation platform of the bead assays, the Caleidosan 300, was used to thermally detach the anti-SARS antibodies bound in the antibody bead assay from their specific sensor molecules (SARS-Cov2 antigens). Very different melting temperatures and melting curve shapes were observed for different sera and recombinant antibodies. Together with the project partners, a clinical study on the significance of antibody binding strength in severe courses of SARS-Cov2 infection is in preparation.