Etablierung eines iPSC-basierten Lungenorganoidsystems als Alternative für tierbasierte Forschungsmodelle

Abstract

Ziel des Projekts war die Entwicklung einer technologischen Plattform zur gezielten genetischen Modifikation humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS-Zellen) und deren Anwendung in komplexen 3D-Zellkulturmodellen. Im Zentrum stand die Etablierung des TRAIT-Systems (Toolbox for Rapid Assembly of Integration Templates) – einer modularen Vektorbibliothek zur schnellen und flexiblen Assemblierung genetischer Konstrukte für stabile Integration in das Genom von iPS-Zellen. Die TRAIT-Plattform kombiniert die Vorteile der Golden Gate- und Gateway®-Klonierung und ermöglicht die Generierung komplexer, multizistronischer Expressionskassetten mit verschiedenen Fluoreszenz- und Resistenzmarkern. Insgesamt wurden im Projekt über 60 funktionelle Plasmide entwickelt und charakterisiert; darunter Werkzeuge zur kontrollierten Genexpression, Geninaktivierung (Knock-out) sowie zur konditionalen Aktivierung onkogener Signalwege. Ein zentraler Anwendungsbereich dieser Technologie war die Erzeugung genetisch definierter iPSC-Linien mit induzierbarer Expression von Cas9 (für CRISPR/Cas9-Geneditierung) sowie konditional aktivierbaren Onkogenen (z. B. KRASG12C, TP53R175H). Es wurden sowohl HEK293- als auch iPSC-basierte Modelle etabliert, in denen die Funktionalität der Expressionskassetten in Bezug auf Induzierbarkeit, Genom-Integration und Genfunktion erfolgreich demonstriert wurde. Ein weiterer wesentlicher Bestandteil des Projekts war die gerichtete Differenzierung dieser genetisch modifizierten iPSC-Linien zu Lungenepithelzellen und die anschließende Generierung von 3D-Lungenorganoiden. Hierfür wurden etablierte Differenzierungsprotokolle angepasst und optimiert. Die entstehenden Organoide zeigten eine reproduzierbare Expression typischer Marker für verschiedene Entwicklungsstadien und spiegelten die Morphologie alveolärer Strukturen wider. Der Differenzierungserfolg variierte je nach Zelllinie, wobei SCVI15-Derivate bessere Ergebnisse erzielten als WTSIi004-A-Derivate. Die Funktionalität der konditionalen Onkogenexpression in Organoiden wurde durch Crevermittelte Rekombination mittels Adeno- oder Lentiviren getestet. Dabei zeigte sich, dass nach Induktion einzelner Organoide eine verstärkte Proliferation und tumorähnliche Strukturen auftraten – ein erster Hinweis auf die erfolgreiche Transformation durch onkogene Signalwege. Die Gesamtfrequenz solcher Ereignisse war jedoch gering, was vermutlich auf Limitierungen in der Rekombinationseffizienz und onkogenen Aktivierung zurückzuführen ist. Alternative Systeme, wie die lentivirale, tetracyclin-regulierte Expression, zeigten vielversprechende Ergebnisse hinsichtlich stabiler Expression und Nachverfolgbarkeit. Insgesamt konnte mit diesem Projekt die Machbarkeit einer gezielten genetischen Modifikation und krankheitsrelevanten Modellierung in iPSC-basierten Organoiden überzeugend demonstriert werden. Das TRAIT-System bietet eine leistungsfähige und flexible Grundlage für zukünftige Anwendungen in der funktionellen Genomforschung, Onkologie und präklinischen Testung. Die entwickelte Plattform ist anschlussfähig an weitere Krankheitsmodelle (z. B. für Leber, Darm, Gehirn) und kann perspektivisch um zusätzliche genetische Module erweitert werden. Die Freigabe der Plasmidbibliothek über Addgene sowie die geplanten wissenschaftlichen Publikationen werden zur breiten Verfügbarkeit und Weiterentwicklung in der Forschungsgemeinschaft beitragen.