Schlussbericht zum Vorhaben: Probenvorbereitung für Einzelzell-Diagnostik durch Photodynamische Lyse (PhotoDynaLysis)

Abstract

Das Projekt „PhotoDynaLysis“ wurde im Rahmen der Bekanntmachung Wisssenschaftliche Vorprojekte (WiVoPro) beantragt und gefördert. Es wurde als Einzelprojekt durch das ILM mit dem Hahn-Schickard Institut für Mikroanalysesysteme (Freiburg) als Unterauftragnehmer durchgeführt. Das Projekt zielte darauf ab, ein photodynamisches (d. h. durch Licht schaltbares) Verfahren für den effizienten Zellaufschluss von Mikroorganismen im Rahmen eines Arbeitsablaufs einer digitalen Rekombinase Polymerase Amplifikationsreaktion (RPA) zu etablieren. Dieses Verfahren ist insbesondere für die Nukleinsäurediagnostik am Point-of-Care bedeutsam. Im Rahmen des Vorhabens wurden zunächst fluoreszenzbasierte (Exo) RPA Assays für repräsentative Modellorganismen für Gram-positive und -negative Bakterien sowie Pilze etabliert. Nach Identifizierung effizienter Protokolle für die photodynamische Inaktivierung der Testorganismen wurden diese hinsichtlich ihrer Kompatibilität mit dem Exo RPA Assay geprüft und angepasst. Im nächsten Schritt erfolgte die Anpassung des Exo RPA Assays von der Echtzeitmessung zur digitalen Messung, wobei mikrofluidische Kartuschen und das erforderliche know-how durch den Unterauftragsnehmer bereitgestellt wurden. Um die Effizienz der photodynamischen Lyse zu verbessern und damit die Projektziele zu erreichen, wurde das Projekt zunächst kostenneutral verlängert und anschließend aufgestockt, wobei die digitale Exo RPA auf die kommerziell verfügbare Stilla Naica Plattform transferiert wurde. Nach erforderlichen Anpassungsarbeiten konnte der photodynamisch vermittelte Bakterienaufschluss in einem digitalen Exo RPA Arbeitsablauf auf dieser Plattform erfolgreich durchgeführt werden. Ein Konzeptnachweis mittels einer Biplex- Exo RPA an humanpathogenen methicillinresistenten Staphylococcus aureus wurde in Zusammenarbeit mit Unterauftragnehmer Hahn-Schickard versucht, jedoch konnte hier bisher keine photodynamische Freisetzung RPA-amplifizierbarer DNA eindeutig nachgewiesen werden. Die Projektergebnisse sind von hoher Relevanz für zellbasierte Multiplex-Assays, da bis dato kein Konzept für einen schaltbaren Zellaufschluss in einem komplexen automatisierten Arbeitsablauf realisiert ist. Effizienz, Reproduzierbarkeit und Universalität des in PhotoDynaLysis erforschten Ansatzes müssen in Folgeprojekten weiter evaluiert werden. Im Erfolgsfall kann das Konzept nicht nur im digitalen Assay, sondern auch in anderen zellbasierten Multiplexanalysen (bspw. Fluoreszenz in situ-Hybridisierung [FISH]) eingesetzt werden. Neben dem attraktiven Konzept der Schaltbarkeit des Zellaufschlusses existieren weitere Vorteile, bspw. die geringen Beschaffungskosten und die hohe Stabilität von Photosensibilisatoren im Vergleich mit rekombinanten Enzymen. Datei-Upload durch TIB