BOAC - Bone-on-a-Chip-System für die präklinische Untersuchung neuer therapeutischer Ansätze für die autosomal rezessive Osteopetrose - Teilprojekt B

Abstract

Die sequenzielle Aussaat und dynamische Kultivierung von Multipotenten adulten Stromalzellen (MSCs), Osteoblasten (hOB) und mononukleären Zellen (Monozyten) auf dezellularisierter menschlicher Spongiosa ermöglicht die Entwicklung klinisch relevanter Bone-on-a-Chip-Systeme zur Analyse genetischer Knochenerkrankungen wie der autosomal rezessiven Osteopetrose (ARO). Diese tödliche Krankheit entsteht durch angeborene Muationsdefekte die zu nicht-funktionalen (knochenabbauenden) Osteoklasten (OC) führt und ist nur durch eine risikoreiche Transplantation von Hematopetischen Stammzellen (HSC) aus geeigneten Spendern behandelbar. Eine Alternative könnte der Einsatz von autologen (Patienten-eigenen) HSCs sein, bei denen der Gendefekt durch somatische Gentherapie korrigiert wurde. Dazu haben wir eine induziert pluripotente Stammzelllinien (iPSCs) von einem ARO-Patienten mit CLCN7-Mutationen (ARO-iPSC) etabliert und ein Methoden zur Differenzierung dieser iPSCs in mononukleäre Zellen (ARO-Monozyten) entwickelt (in 2D Kulturen), die weiter zu Osteoklasten (ARO-OC) reifen können. Wie beim Patienten resorbieren diese ARO-OC keinen Knochen in 2D-Kulturen, allerdings könnte durch eine genetische Korrektur der CLCN7-Mutationen die Resorptionsaktivität wiederhergestellt werden. Diese ARO-iPSCs sollen für die Testung zweier Gentherapieansätze verwendet werden: 1. CRISPR/Cas9-Integration eines therapeutischen Konstrukts in einen Safe Harbor Locus, 2. Integration eines Transposon-basierten Konstrukts (Arbeiten des Projektpartners). Beide Ansätze werden zunächst in 2D-Kulturen getestet, allerdings kann das Verhalten der gentechnisch therapierten Zellen nur in Langzeit-3D-Kulturen (Bone-on-a-Chip-System) verlässlich beurteilt werden. Solche System sind jedoch derzeit weder etabliert, noch überhaupt verfügbar. Ziel dieses Teilprojektes war es daher entsprechende Protokolle und Methoden zu entwicklen, um iPSC-basierte Monozyten (mit und ohne Gendefekt) auf 3D-Gerüsten zu Osteoklasten zu differenzieren, anschließend diese Konstrukte mit MSCs und Osteoblasten zu besiedeln und in einer Langezeitkultur zu untersuchen. Anschließlich sollte dieses System genutzt werden um die Sicherheit und Funktionalität von gentechnisch therapierten IPSC- Vorläuferzellen zu beurteilen. Der menschliche Knochen umfasst auch das Knochenmark, welches nicht nur der Ursprung von Blut- und Immunezellen ist, sondern auch als Speicher der Immunerfahrung dient. Daher wurde in einem explorativen Schritt das komplexe System um die Immunerfahrung erweitert, indem Mononukläre Knochenmarkszellen zustätzlich in das System gegeben wurden. Dieser neuartige Ansatz sollte eine bessere präklinische Prüfung neuer Gentherapien (für ARO) ermöglichen und helfen bisher verwendete Mausexperimente zu reduzieren, welche die humane Situation nur bedingt widerspiegeln.