Fluoreszenzquantifizierung bakterieller Endosporen mittels Apazympaaren und Molecular Beacons

Abstract

Einige bakterielle Erreger können sehr widerstandsfähige Endosporen ausbilden, die sich bei routinemäßigen Reinigungs-/ Desinfektionsmaßnahmen unter Einsatz bakterizid wirkender Desinfektionsmittel und -verfahren nicht mit ausreichender Sicherheit beseitigen lassen und bis zu mehreren Monaten auf Oberflächen oder Textilien überdauern können. Ziel war es daher, ein eigenständig, ohne Fachkenntnisse auswertbares Verfahren zu realisieren, das eine simultane Quantifizierung auskeimungsfähiger Endosporen (Gesamtsporenzahl anaerober bzw. aerober Bakterien) und auskeimungsfähiger Endosporen hygienerelevanter Bakterien (z. B. C. difficile, B. cereus) ermöglicht. Ein solches Verfahren würde Reinigungs- und textile Dienstleister erstmals befähigen, die Sporenbelastung von Oberflächen, Textilien und Prozesswässern im Rahmen innerbetrieblicher Eigenkontrollen eigenständig zu bewerten und somit den Erfolg von ihnen vorgenommener Dekontaminationsmaßnahmen zu überwachen. Im Fokus der Forschungsarbeiten standen aus Nukleinsäuren (bevorzugt DNA) bestehende Moleküle, die in Gegenwart von Sporen durch Interaktion miteinander ein Fluoreszenzsignal generieren: Zum einen wurden sog. Aptamere identifiziert, die an spezifische Zielmoleküle auf der Sporenoberfläche hygienerelevanter Bakterien (C. difficile, B. cereus) bzw. an einen ausgewählten Quencher binden. Zur Quantifizierung von Endosporen (Gesamtsporenzahl anaerober bzw. aerober Bakterien) sowie zum Nachweis der Auskeimungsfähigkeit der Sporen wurde Dipicolinsäure als Zielmolekül ausgewählt; gegen Dipicolinsäure konnte aber auf Basis umfassender Literaturrecherchen kein Aptamer identifiziert werden. Daher wurde Dipicolinsäure auf magnetischen Beads immobilisiert und DNA-Stränge selektiert, die daran banden. Die Stränge wurden sequenziert. Die Sequenzierdaten wurden biostatistisch ausgewertet, um potentielle Aptamere zu identifizieren. Zum anderen wurden DNAzyme identifiziert, die über eine katalytische Aktivität verfügen und gemäß Literaturangaben eine hohe Wechselzahl aufweisen. Für die DNAzyme wurden fluorogene Substrate designt: Dabei handelte es sich u. a. um spezifische DNA-Stränge, die eine Stammschleifenstruktur ausbilden, in der der an dem einen Strangende gebundene Fluorophor und der an dem anderen Strangende gebundene Quencher in unmittelbarer Nähe zueinander vorliegen, sog. Molecular Beacons. Zur Entwicklung von Aptazymen wurden exemplarisch das DNAzym DET22-18 und das Aptamer BacApt3, welches sich gegen Endosporen des Bakteriums B. cereus richtet, verwendet. Das Aptazym wurde sowohl durch enzymatische Ligation als auch durch bioinformatisches Design generiert. Die katalytische Aktivität des Aptazyms und des DNAzyms unterschieden sich nur geringfügig; folglich war das Aptazym nicht allosterisch kontrolliert. Bei Charakterisierung von DNAzymen und Aptazym hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität war festzustellen, dass der Substratumsatz bzw. die Konzentration an gespaltenem Substrat deutlich unterhalb der Konzentration an DNAzym und Aptazym im Reaktionsansatz lag. Diese Beobachtung legte nahe, dass die Substratstränge nach der Spaltung durch das DNAzym bzw. Aptazym im hybridisierten Zustand verblieben und sich nicht bzw. nur mit sehr geringer Geschwindigkeit von ungespaltenen Substratsträngen verdrängen lassen. Wurden die Ansätze einer thermozyklischen Behandlung (mehrfaches Erwärmen und Abkühlen) unterzogen, konnte das Substrat, das im vierfachen Überschuss vorlag, nahezu vollständig gespalten werden; folglich war davon auszugehen, dass ein Substratwechsel erfolgte. Unter diesen Bedingungen ist eine Quantifizierung von Endosporen auf einem Beprobungsmedium als nicht praktikabel anzusehen. Nach Bindung eines Aptazyms an die Oberfläche von Endosporen hygienerelevanter Bakterien und anschließender Inkubation mit Substrat war ein fluoreszenzmikroskopischer Nachweis möglich, eine Quantifizierung kann durch Auszählen der fluoreszierenden Sporen z. B. unter Verwendung eines Zählgitters erfolgen. Das Ziel des Forschungsvorhabens wurde teilweise erreicht. Datei-Upload durch TIB