Verbundprojekt: Zeitaufgelöste Fluoreszenzdetektion für die integrierte Multiparameter-Analyse von Multiresistenzen beispielgebend bei Tuberkulose - FluoResYst; Teilvorhaben: Plattformkompatible Templatamplifikation und Validierung

Abstract

Die Integration molekularer Diagnostikmethoden in portable Plattformen, insbesondere zur Detektion von Pathogenen mit bekannten genetischen Mutationen, die Antibiotikaresistenzen vermitteln, ist entscheidend für eine effektive Diagnostik und Behandlung vieler Infektions- krankheiten. Das Teilvorhaben “FluoResYst - Plattformkompatible Templat-amplifikation und Validierung” hatte zum Ziel, eine molekulare Amplifikationsmethode zu entwickeln und zu optimieren, die mit der vom Projektkonsortium entwickelten Plattform kompatibel ist. Konkret sollte die Methode 1) bei einer einzigen konstanten Temperatur (isotherm) durchgeführt werden und 2) Amplifikationsprodukte erzeugen, die mit einer Nucleinsäure Sonden-basierte Mikroarray Plattform zur Detektion von Einzelnukleotid-polymorphismen (SNPs) kompatibel sind. Gemäß dem übergeordneten Ziel des Gesamtverbundes haben wir die Detektion von Tuberkulose (TB) sowie einiger Reisistenzen in den Fokus genommen. TB ist weiterhin weltweit die häufigste Todesursache, die durch einen einzelnen Infektionserreger (M. tuberculosis) ausgelöst wird. Obwohl diese Erkrankung durch Antibiotika heilbar ist, erschwert das zunehmende Auftreten (multi-) resistenter Stämme die Behandlung erheblich und erfordert eine präzise Diagnostik genetischer Mutationen, die mit Arzneimittelresisten-zen assoziiert sind. In diesem Teilprojekt haben wir acht Gene als Target definiert, sechs davon mit bekannten Mutationen, die ursächlich mit Antibiotikaresistenz in Verbindung stehen. Die Arbeitspakete wurden entsprechend definiert: a) Anpassung isothermer Methoden zur Amplifikation spezifischer genetischer Zielsequenzen (einschließlich resistenzassoziierter Gene) b) Anpassung der Amplifikation für den Read-out auf einem Mikroarray und Generierung von Amplikons für Projektpartner c) Multiplex-Amplifikation und -Detektion d) Anpassung an das Gesamtsystem Isothermale Amplifikation war zum Projektbeginn noch nicht für MDR- und XDR-Tuberkulose POCT-fähig entwickelt worden, insbesondere gab es kein Verfahren, das mit dem Fluores- zenzquenching- Verfahren kombiniert wurde. Daher wurden von uns zwei isothermale Methoden getestet: Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) und Recombinase Polymerase Amplification (RPA). Obwohl beide Methoden erfolgreich für die Amplifikation der Targets im Projekt optimiert werden konnten, und wir gezeigt haben, dass beide Methoden hinreichend spezifische und empfindliche Amplifikation erreichen, wurde LAMP in Absprache mit unseren Partnern (IZI-BB und Microfluidic ChipShop) und dem Projektleiter (Lionex) als bevorzugte Methode ausgewählt. Dementsprechend wurden 8 Primersets für jedes Gen-Target erzeugt und die Methode wurde erfolgreich charakterisiert und für jedes molekulare Ziel optimiert. Spezifität der entwickelten Primersets wurde durch einen Fluorophor-Quanching-Sonden (FQ- Probes) Assay charakterisiert. Doppelsträngige, sequenz-spezifische Proben wurden für jedes Genziel entwickelt, sodass Fluoreszenzsignale nur entstanden, wenn das molekulare Target korrekt amplifiziert wurde. Diese Methode erlaubte auch die spezifische und gleichzeitige Detektion verschiedener Targets, wenn die Sonden spektral nicht überlappende Fluorophore enthielten. Die ursprünglich geplante Typisierung der TB-Stämme basierte auf einem Mikroarray mit Quenching-Assay, bei dem LAMP-Amplifikate direkt mit immobilisierten Sonden hybridisieren sollten. Früh im Projekt stellte der Projektpartner IZI-BB jedoch fest, dass der Quenching-Assay mit den verfügbaren Mitteln nicht auf ein Mikroarray übertragbar ist. Daher musste unsere LAMP- Methode angepasst werden. Die gewählte Lösung bestand darin, den Fluoreszenzfarbstoff TAMRA bereits während der Amplifikation in die DNA einzubauen. Dazu wurden TAMRA- markierte dUTPs verwendet, die während der LAMP-Amplifikation in die Amplikons integriert wurden. Dadurch enthalten die erzeugten DNA-Produkte mehrere Fluorophore und erzeugen bei der Hybridisierung auf dem Mikroarray unmittelbar ein messbares Fluoreszenzsignal. Die Änderung des molekularen Mechanismus zur spezifischen Signalgenerierung weg vom Mikroarray hin zur Amplifikation konnte so ausgeführt werden, dass der Prozessablauf in der von den Partner zu entwickelnden Bereichen nicht geändert werden musste. Es zeigte sich jedoch, dass hohe Konzentrationen von TAMRA-dUTP die Amplifikation hemmen können. Deshalb wurde die LAMP-Reaktion durch verschiedene Amplifikations-verstärker optimiert. Dabei verbesserten insbesondere Betaine und T4 Gen 32 Protein die Fluoreszenzsignale. Betaine wurde anschließend standardmäßig eingesetzt. Das T4 Gen 32- Protein verzögerte zwar den Beginn der Amplifikation, ermöglichte jedoch auch bei höheren TAMRA-dUTP-Konzentrationen eine erfolgreiche Farbstoffintegration. Insgesamt ermöglichte die direkte Inkorporation von TAMRA-dUTP eine erfolgreiche Anpassung der LAMP-Methode an die Mikroarray-basierte Fluoreszenzdetektion und stellte sicher, dass der geplante Gesamtnachweis ohne strukturelle Änderungen im Projekt umgesetzt werden konnte. Durch eine im Projekt etabillierte Kollaboration mit dem Forschungszentrum Borstel (Referenzzentrum für Tuberkulose), haben wir aufgereinigte DNA von TB-Stämme erhalten. Diese trugen mindestens eine, viele auch mehrere, Mutationen, die Antibiotika Resistenzen erzeugen (MDR). Dieses genetische Material wurde dann für alle 8 Targets mit unserer modifizierten LAMP-Methode amplifiziert und mit TAMRA-markiert und für die Detektion auf dem Mikroarray an unser Projektpartner IZI-BB geliefert. Die entstandenen LAMP-Amplikons wurden anschließend ohne weitere Aufreinigung zusammengeführt („gepoolt“) und als Testmaterial für das im Projekt entwickelte Kartuschensystem verwendet. Die Messung der Hybridisierung erfolgte durch den Projektpartner IZI-BB und zeigte, dass alle Zielgene gleichzeitig auf dem Mikroarray detektiert werden können. Allerdings wurden teilweise Signale unspezifischer Sonden beobachtet, weshalb eine weitere Optimierung der Hybridisierungs-bedingungen notwendig ist, um Kreuzreaktivität zwischen Sonden mit hoher Sequenzähnlichkeit zu reduzieren. Für die Integration in das Gesamtsystem mussten zusätzlich reale Probenbedingungen berücksichtigt werden, insbesondere die Probenmatrix sowie das begrenzte Volumen der mikrofluidischen Reaktionskammer. Dafür haben wir erst verschiedene Verflüssigungslösungen getestet, um die mit DNA-gespiked Muzin-Proben zu lösen und die LAMP in dieser Matrix zu optimieren. Die Ergebnisse zeigten, dass Ziel-DNA erfolgreich extrahiert und amplifiziert werden konnte, selbst bei Proben mit hohen Muzinkonzentrationen. Für das kleine Reaktionskammervolume, wurde die LAMP-Reaktion auf 5 µl umgestellt. Hier konnten wir auch erfolgreiche Amplifikation des Targets und die erfolgreiche Anpassung an die Bedingungen von der mikrofluidische Kartusche (entwickelt von Microfluidic ChipShop) durchführen. Damit konnte gezeigt werden, dass die entwickelte Methode auch unter realistischen Proben- und Gerätbedingungen nach geeigneter Probenvorbereitung zuverlässig funktioniert.