Bioökonomie International 2019: ScampiLys - Produktion von Lysin aus Shrimpabfällen für Futtermittelzusatzstoffe unter Nutzung eines metabolisch optimierten Vibrio natriegens Stammes

Abstract

Die Zusammenarbeit zwischen der Hanoi University of Science and Technology (HUST) und der Professur für Bioverfahrenstechnik an der TU Dresden hatte das Ziel, neue Verfahrensansätze für die Nutzung von Shrimpabfällen zu entwickeln, deren Entsorgung in Vietnam ein zunehmendes Umweltproblem darstellt. Dabei war die HUST für die Entwicklung von effizienten Hydrolysemethoden für die Shrimpabfälle zuständig und die TU Dresden für die Konstruktion eines Produktionsstamms zur Umwandlung der Chitinmonomere Glukosamin und N-Acetly-Glukosamin in die Aminosäure L-Lysin. Vibrio natriegens, der am schnellsten wachsende bisher bekannte nicht-pathogene Mikroorganismus, hat sich als vielversprechender Chassis-Stamm für Anwendungen in der synthetischen Biologie und Biotechnologie erwiesen. Der Organismus ist extrem salztolerant und kann Chitinmonomere sehr effektiv verwerten. Daher wurde dieses Bakterium als Basis für die Konstruktion eines Lysinproduzenten gewählt. Die Arbeiten an der TU Dresden fokussierten auf die Aufklärung der genetischen Basis und Regulation des Lysinstoffwechsels in V. natriegens, dem metabolic engineering von V. natriegens um eine Lysinproduktion zu ermöglichen sowie der Untersuchung des Stoffwechsels von V. natriegens, um weitere Produktivitätssteigerungen durch eine Manipulation des ATP-Stoffwechsels zu ermöglichen. Zunächst wurde der Aufbau und die Regulierung des Biosynthesewegs für L-Lysin und verwandte Aminosäuren der L-Aspartat-Familie (AFAAs) in V. natriegens DSM759 analysiert, um eine umfassende Grundlage für künftige metabolische Engineering-Bemühungen zu schaffen, die darauf abzielen, diesen Stamm zu einem Aminosäure-Überproduzenten zu entwickeln. Die Zusammenstellung der automatisch annotierten Genomsequenzierungsdaten ergab das Vorhandensein von Genduplikaten, die für mutmaßliche Isoenzyme für mehrere enzymatische Reaktionen innerhalb dieser Stoffwechselwege kodieren. Die physiologische Rolle dieser Isoenzyme wurde durch Wachstumsphänotypisierung der entsprechenden Gendeletionsmutanten sowie durch enzymatische Assays analysiert. Wir haben das Vorhandensein eines bisher unbekannten monofunktionellen Aspartatkinase-Isozyms nachgewiesen, das hier als Vn.LysC2 bezeichnet wird und sich als unempfindlich gegenüber allosterischer Hemmung durch AFAA erweist. Darüber hinaus wurden funktionelle Duplikate der Enzyme L-Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase und Dihydrodipicolinat-Synthase identifiziert. Mit Hilfe von RNA-Sequenzierungsexperimenten wurde die durch AFAAs vermittelte Transkriptionsregulierung sowohl auf die entsprechenden Biosynthesewege als auch auf den globalen Stoffwechsel untersucht. Die Anwesenheit von L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin und L-Methionin führte zu einer transkriptionellen Repression der jeweiligen Biosynthesewege. Auf Basis dieser Ergebnisse wurden Lysin-produzierende V. natriegens Stämme konstruiert. Dabei erwies es sich als essentiell, eine DapA Mutante einzusetzen, die durch Mutation resistent gegenüber einer Feedback-Inhibierung durch Lysin gemacht wurde. Die Lysinproduktion wurde durch die parallele Überexpression der von Natur aus Lysin-resistenten Aspartatkinase Vn.LysC2 weiter erhöht. Untersuchungen zur Medienoptimierung zeigten, dass eine Schwefellimitation in definierten Mineralmedien zu den höchsten Lysinerträgen führt. In Schüttelkolbenversuchen wurden Lysinerträge von 0,13 mol/mol bezogen auf verbrauchte Glukose erzielt. Der gleiche Stamm war in der Lage, das Chitin-Monomer N-Acetylglucosamin mit einem Ertrag von 0,09 mol/mol zu Lysin umzuwandeln, während auf den Chitinmonomer Glucosamin keine Lysinproduktion beobachtet wurde. Weiterhin wurde die Möglichkeit untersucht, die Glukoseaufnahmeraten und damit die spezifischen Produktivitäten von V. natriegens Stämmen durch eine Manipulation des ATP-Stoffwechsels weiter zu erhöhen. Dazu wurden ATP-verbrauchende Enzyme (ATPasen) in unterschiedlichen Stärken im Produktionsstamm exprimiert und die physiologische Antwort der Zellen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen untersucht. Es wurde gezeigt, dass sich die Glukoseaufnahmeraten von V. natriegens unter aeroben Bedingungen nicht weiter steigern lassen, solange die Zellen exponentiell wachsen. Im Gegensatz dazu zeigen stationäre Zellen eine bis zu dreimal höhere Glukoseaufnahme wenn der ATP-Verbrauch künstlich gesteigert wurde. Zusammengenommen stellen diese Ergebnisse wichtige Grundlagen für die Etablierung von V. natriegens als Produktionsorganismus für die Aminosäure Lysin und die weitere Verbesserung der Leistungsfähigkeit dieses Organismus für industrielle Herstellungsprozesse dar.