Catch-Sweep-Fluoreszenzindikator zum kontinuierlichen Monitoring des mikrobiellen Zustands von Tuchspendersystemen

Abstract

In Einrichtungen des Gesundheitswesens und der Pflege werden für die Flächendesinfektion häufig Tuchspendersysteme eingesetzt. Gebrauchsfertige Systeme können nach Herstellerangaben bis zu 28 Tage eingesetzt werden. Jedoch wurden in der Praxis auch während der vom Hersteller angegebenen Standzeiten wiederholt massive mikrobielle Kontaminationen ermittelt. Um solche Kontaminationen zu erkennen, empfiehlt die Desinfektionsmittel-Kommission im Verbund für Angewandte Hygiene (VAH e.V.) eine periodische Untersuchung der Tuchspendersysteme. Diese erfolgt mit klassischen mikrobiologischen Kultivierungsverfahren, welche nur von Fachpersonal in mikrobiologischen Laboren durchgeführt werden können und hohe Kosten verursachen. Da die Ergebnisse erst nach etwa 2-4 Werktagen vorliegen, können Korrekturmaßnahmen nur mit zeitlicher Verzögerung erfolgen. Ziel des Forschungsvorhabens war ein Monitor-System zum Nachweis vitaler Bakterien in Desinfektionsmittellösungen von Tuchspendersystemen, bei dem die Bakterien auf der Monitor-Oberfläche binden („catch“) und anschließend mittels eines molekularen Mechanismus über die gesamte Monitor-Oberfläche geführt werden („sweep“). Dabei lösen von den Bakterien sezernierte Nukleasen die Aktivierung von Fluoreszenzreportern aus, wodurch ein intensives Fluoreszenzsignal generiert wird. Für die Bindung von Bakterien in Desinfektionsmittellösungen dienende Aptamere wurden mittels eines SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)-Prozesses entwickelt und die Sequenz dieser DNA-Oligonukleotide durch Sequenzierung bestimmt. Das zur Aptamer-Bindung eingesetzte Ankerfilament bestand aus einer hydrolysierbaren Nukleinsäuresequenz, an die komplementäre Aktivatoren gebunden werden konnten. In Gegenwart lebender Keime konnte eine hydrolytische Degradierung der Ankerfilamente nachgewiesen werden, was zur Freisetzung der Aktivatoren führte. Die Aktivatoren bestanden aus Peptide Nucleic Acids (PNA) und unterlagen keiner Degradierung; sie zeigten jedoch eine unzureichende Bindung an Ankerfilamente. Daher wurden Aktivatoren, die aus Locked Nucleic Acids (LNA) aufgebaut waren, entwickelt. Diese LNA-haltigen Aktivatoren zeigten eine gute Stabilität gegenüber Nukleasen und konnten durch Hybridisierung stabil an Ankerfilamente gebunden werden. Parallel hierzu wurde ein ebenfalls nukleasestabiler, LNA-basierter Fluoreszenzreporter entwickelt, der über eine teilkomplementäre Sequenz zum Aktivator verfügte, was eine Bindung der beiden Oligonukleotide aneinander gewährleistete. Durch die Bindung des Aktivators an den Fluoreszenzindikator ließ sich ein starkes Fluoreszenzsignal generieren. Zur Immobilisierung der Ankerfilamente und der LNA-basierten Fluoreszenzreporter wurden beide terminal mit einer Thiolgruppen-Modifikation versehen. Hierdurch konnten die Ankerfilamente und die Fluoreszenzreporter kovalent an silanisierte Glasoberflächen gekoppelt werden. Die Funktionsfähigkeit der Einzelkomponenten des Monitor-Systems konnte demonstriert werden. Das Ziel des Forschungsvorhabens wurde teilweise erreicht. Datei-Upload durch TIB