At site-Quantifizierung von Fibrinrückständen auf medizinischen Instrumenten

Abstract

Nach Gebrauch weisen chirurgisch oder diagnostisch eingesetzte Medizinprodukte eine hohe Kontamination auf, weshalb eine gründliche Aufbereitung erforderlich ist. Diese orientiert sich an der sog. KRINKO/BfArM-Empfehlung und umfasst u.a. eine sorgfältige Reinigung, Desinfektion und ggf. Sterilisation der Instrumente in Aufbereitungseinheiten für Medizinprodukte (AEMP). Die Aufbereitung muss mit validierten Verfahren erfolgen. Zur Aufrechterhaltung der Validierung sind u.a. regelmäßige Leistungsqualifizierungen und Routinekontrollen durchzuführen. Ein zentraler Schritt der Aufbereitung ist die Reinigung, deren Effektivität durch die Messung von Restverschmutzungen kontrolliert wird. Der Proteingehalt dient hierbei als Leitparameter. Die KRINKO/BfArM-Empfehlung fordert, dass zur Unterschreitung der Warngrenze ein Restproteingehalt von ≤ 100 μg pro Instrument bzw. ein Protein/Flächenbezug von < 3 μg/cm2 einzuhalten ist. Die anspruchsvollste Anschmutzung stellen Fibrinrückstände dar, da diese nicht mit etablierten Methoden zwecks nachfolgender Proteinquantifizierung eluiert werden können, sodass zur Detektion von Rückständen bei Instrumenten mit verdeckten Oberflächen oder Hohlräumen eine ggf. zerstörende Demontage notwendig ist. Die im Forschungsprojekt entwickelte At site-Quantifizierung von Fibrin ermöglicht die direkte Messung von Fibrinrückständen auf Instrumentenoberflächen: das Verfahren setzt spezifisch Fibrin-bindende Hybridmoleküle ein, die thermisch ablösbare Signalmoleküle freisetzen, welche mit einem Flip up-Fluoreszenzindikators quantifiziert werden können. Es wurden Hybridmoleküle entwickelt, die aus einem mit Signal-Oligonukleotiden beladenen Träger-Oligonukleotid bestehen und mit dem spezifisch Fibrin-bindenden CREKA-Pentapeptid funktionalisiert sind. Die 80 Nukleotide langen Signal-Oligonukleotide wurden so entworfen, dass sie eine Haarnadelschleife bilden, was zu einer Verringerung unerwünschter Adhäsion an Instrumentenoberflächen führt. Die Schmelztemperatur zur Ablösung der Signal-Oligonukleotide vom Hybridmolekül betrug 50 °C, wobei die Haarnadelschleife bis 65 °C stabil blieb. Die Effizienz der Beladung der Träger-Oligonukleotide mit Signal-Oligonukleotiden lag je nach Anzahl der Bindestellen für Signal-Oligonukleotide zwischen 76 % und 100 %. Zur vollständigen Assemblierung des Hybridmoleküls erfolgte eine Hybridisierung mit einem CREKA-Pentapeptid, welches kovalent mit einem 30 Nukleotide langen Anker-Oligonukleotid verbunden war. Die spezifische Bindung des Hybridmoleküls an Fibrin konnte mittels Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzspektrometrie erfolgreich nachgewiesen werden. Zur Detektion der thermisch ablösbaren Signal-Oligonukleotide wurde ein Flip up-Fluoreszenzindikator entwickelt. Dieser bestand aus Fluorophor-funktionalisierten Flip up-Oligonukleotiden mit Komplementarität zu den Signal-Oligonukleotiden. Bei Abwesenheit von Signal-Oligonukleotiden wurde die Fluoreszenz der Flip up-Oligonukleotide effizient durch Graphenoxid gelöscht (gequencht). Thermisch abgelöste und eluierte Signal-Oligonukleotide banden an die Flip up-Oligonukleotide, was zur Generierung eines starken Fluoreszenzsignals führte. Die Entwicklung eines thermisch regenerierbaren Fluoreszenzindikators, welche eine kovalente Bindung der Flip up-Oligonukleotide an Graphenoxid voraussetzt, konnte noch nicht realisiert werden, jedoch kann der entwickelte Fluoreszenzindikator aufgrund der geringen Kosten als Einweg-Indikator problemlos verwendet werden. Die Funktionalität der At site-Markierung von Fibrin wurde an Fibrin-Prüfkörpern und Arterienklemmen verifiziert. Hierbei wurde eine erfolgreiche At site-Markierung der Fibrin-Rückstände mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Die Elutierbarkeit der Signal-Oligonukleotide bei einer Behandlungstemperatur von 75 °C wurde demonstriert und die Menge der eluierten Signal-Oligonukleotide quantifiziert. Es ist davon auszugehen, dass spezialisierte Reinigungs- und Hygienedienstleister, Prüflaboratorien sowie Hersteller von molekularbiologischen Reagenzien aufbauend auf den Projektergebnissen im Rahmen der Produktentwicklung innerhalb der nächsten Jahre innovative Reagenzien-Kits zur At site-Quantifizierung von Fibrinrückständen auf Medizinprodukten entwickeln und vermarkten werden. Das Ziel des Forschungsvorhabens wurde erreicht. Datei-Upload durch TIB